鐵皮石斛莖段原球莖的誘導(dǎo)增殖與分化

黃楚燕 梁宏宇

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣州,510405; 2 廣東省第二中醫(yī)院,廣州,510405)

鐵皮石斛是蘭科石斛多年生草本植物,據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載,其味甘,歸胃、腎經(jīng),性微寒;具有滋陰清熱,益胃生津等功效。近代研究表明鐵皮石斛的多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗氧化以及降血糖等方面的作用。通過人工培養(yǎng)技術(shù)可以有效地?cái)U(kuò)大其生長產(chǎn)量,組培工廠化的生育苗一般需要保證配方的穩(wěn)定,增殖系數(shù)比較高,種苗的質(zhì)量有保障。近幾年以來出現(xiàn)了很多鐵皮石斛組織培養(yǎng)的企業(yè),通過莖段原球莖的途徑可以讓最終生產(chǎn)出的種苗都來自同一顆木本,這樣就可以讓其后期的種苗整齊一致,而且還可以有效地提高增殖系數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料 野生的鐵皮石斛是此次試驗(yàn)最重要的素材,其對于生長環(huán)境以及氣候等方面的要求標(biāo)準(zhǔn)非常高,很多時(shí)候都是將其種植在溫室大棚中[1]。這樣可以有效控制其生長所需的濕度、溫度以及透光度等條件,在此選擇生長健康的,沒有病蟲災(zāi)害的當(dāng)年嫩莖將其除葉作為試驗(yàn)材料[2],如圖1所示。

1.2 方法

1.2.1 消毒處理 主要操作流程就是自來水沖洗-流水沖洗-濾紙吸干水分[3]。將其在超凈的工作臺上進(jìn)行修剪,剪成每個(gè)段都包含1～2個(gè)莖節(jié),長度約為3 cm。接下來將其放在濃度為75%的乙醇中浸泡,時(shí)間為30 s,到時(shí)間后再將其放入濃度為0.1%的升汞溶液中浸泡,時(shí)間為6 min[4]。最后就需要再沖洗1次,一般是采用無菌水,再通過無菌濾紙完成干燥處理,然后將終端的傷口進(jìn)行切除處理形成帶一個(gè)節(jié)的段,然后再將其接種到試驗(yàn)培養(yǎng)基。

1.2.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基的配備 以VW(Vacin and Went)培養(yǎng)基、1/2MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基和MS作為試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基來進(jìn)行試驗(yàn),在添加相關(guān)生長調(diào)節(jié)劑的時(shí)候需要根據(jù)不同的培養(yǎng)時(shí)期來配置不同比例和濃度,另外還需要考慮將香蕉和馬鈴薯等作為附加物添加到培養(yǎng)基內(nèi)部。在添加的過程中要注意對馬鈴薯進(jìn)行相關(guān)處理,先去掉外皮然后再進(jìn)行稱重,再將其切成小塊,在使用之前還需要將其煮爛打碎成漿[5];同樣對于香蕉的使用前也要進(jìn)行稱重剝皮,然后研磨成香蕉泥才可以使用。所有的培養(yǎng)基都需要調(diào)節(jié)其pH值為5.6,還需要添加瓊脂7 g/L,這樣保持在121 ℃的狀況下保持20 min目的就是進(jìn)行有效的滅菌,然后等其冷卻凝固后再使用[6]。

2.3 原球莖誘導(dǎo) 采用正交的試驗(yàn)方式對N-乙酰天冬氨酸(N-acetyl-aspartate，NAA)(0.1、0.5、1.0 mg/L)、6-芐氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)(1、2、4 mg/L)以及基本培養(yǎng)基(MS,1/2MS,VW)對原球莖誘導(dǎo)率產(chǎn)生的影響進(jìn)行研究分析,具體展開過程中,首先對所有培養(yǎng)基依次添加30 g/L蔗糖[7]。其次把莖段接種每個(gè)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),單次接種處理數(shù)量為30瓶,1瓶對應(yīng)1個(gè)莖段[8]。

2.4 原球莖增殖和分化處理 依然通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方式對馬鈴薯泥質(zhì)量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、10%、20%)、蔗糖(不同含量10、20、30 g/L)以及基本培養(yǎng)基(MS,1/2MS,VW)對原球莖增殖和分化產(chǎn)生的具體影響進(jìn)行研究分析。首先對適合原球莖增殖分化的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。其次采取頂部具備葉原基、顏色為淡綠色、沒有出現(xiàn)真葉分化的原球莖,并對其進(jìn)行切割形成直徑在1.0～1.5 cm的小塊,切割完成后接種到不同的培養(yǎng)基當(dāng)中,單次處理接種數(shù)量為20瓶,一瓶對應(yīng)10塊原球莖[9]。見圖2。

2.5 生根培養(yǎng) 為了能夠篩選出最佳適宜生根的培養(yǎng)基,采用正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方式來研究馬鈴薯泥(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、10%、20%)、萘乙酸(NAA)(0.1、0.5、1.0 mg/L)以及香蕉泥(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、10%、20%)的用量,每個(gè)培養(yǎng)基同樣需要添加蔗糖含量為20 g/L。取高度范圍在1.0～1.5 cm的小苗,將其依次接種到每個(gè)生根培養(yǎng)基當(dāng)中,單次處理接種數(shù)量為20瓶,1瓶對應(yīng)12叢小苗,每叢小苗上要保證具備3～4個(gè)芽[10]。

2.6 培養(yǎng)試驗(yàn)所需條件 對于試驗(yàn)所需條件也應(yīng)該給予嚴(yán)格的規(guī)定,各個(gè)培養(yǎng)階段的光照時(shí)間應(yīng)該滿足12 h/d,培養(yǎng)室內(nèi)部的溫度也應(yīng)該保持在(27±2)℃,內(nèi)部光照強(qiáng)度也要維持在4 000～5 000 lx。

3 結(jié)果

3.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑、基本培養(yǎng)基配比對于莖段原球莖的誘導(dǎo)影響效果 在原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)的試驗(yàn)上接種消毒后的莖段,大約培養(yǎng)20 d后腋芽就開始出現(xiàn)逐漸膨大的跡象,30 d后就會萌發(fā)出不定芽。然后在經(jīng)過2個(gè)月的培養(yǎng)后對生長出的不定芽進(jìn)行切割,使其脫離莖段,然后將其轉(zhuǎn)接到相同的培養(yǎng)基當(dāng)中進(jìn)行3個(gè)月的后續(xù)培養(yǎng),并對原球莖的誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì),其結(jié)果如表1所示。通過簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)檢驗(yàn),最終發(fā)現(xiàn)6-BA和基本培養(yǎng)基為鐵皮石斛莖段原球莖誘導(dǎo)率帶來的影響更加突出,NAA各個(gè)水平間并無明顯差異。而1/2MS和MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)率的平均值分別可以達(dá)到17.20和28.40,二者結(jié)果相差不大,但是和VM誘導(dǎo)率平均值4.80比較,相差顯著;另外,濃度為4 mg/L的6-BA其誘導(dǎo)率均值結(jié)果為25.30,和1 mg/L的誘導(dǎo)率存在較大差異。結(jié)合以上數(shù)據(jù)結(jié)果,可以得出:最適宜誘導(dǎo)鐵皮石斛莖段原球莖的培養(yǎng)基組合是NAA 0.1 mg/L+1/2MS+6-BA 4.0 mg/L。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑、基本培養(yǎng)配比誘導(dǎo)莖段原球莖簡單重復(fù)序列檢驗(yàn)結(jié)果分析

3.2 不同基本培養(yǎng)基、馬鈴薯泥以及蔗糖濃度增殖分化原球莖效果 基本培養(yǎng)基對于鐵皮石斛莖段原球莖的增殖率和分化率影響都有著明顯的效果,其中MS的增殖率達(dá)到了11.80,效果是最好的,相比VW和1/2MS的增殖率效果差異非常明顯。而分化率則是均值為5.86的1/2MS效果最佳,和MS的分化率呈現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢。蔗糖對于鐵皮石斛莖段原球莖的增殖和分化效果也比較明顯,馬鈴薯泥的影響相對來說均沒有達(dá)到顯著的差異,但是增加了10%的馬鈴薯泥后鐵皮石斛莖段原球莖的分化苗變得更加粗壯。因此,可以得出的結(jié)論就是鐵皮石斛莖段原球莖增殖最佳的培養(yǎng)基是:MS+蔗糖30 g/L;分化的最佳培養(yǎng)基是:馬鈴薯泥10%+蔗糖10 g/L+1/2MS。該正交試驗(yàn)結(jié)果見表2～3。

表2 不同基本培養(yǎng)基、馬鈴薯泥和蔗糖增殖分化原球莖效果分析

3.3 香蕉泥、NAA和馬鈴薯泥對鐵皮石斛莖段原球莖生根效果的分析 試驗(yàn)過程中將分化后的鐵皮石斛莖段原球莖接入馬鈴薯泥10%+蔗糖10 g/L+1/2 MS中培養(yǎng)大約2個(gè)月的時(shí)間,苗高在1～1.5 cm上下然后將其接到生根的培養(yǎng)基4個(gè)月的時(shí)間,然后統(tǒng)計(jì)其生根的根長、根數(shù)以及苗柱高度(圖3)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，NAA對于根長以及根數(shù)的影響效果較好,對于苗柱的高度影響方面不是非常明顯;馬鈴薯泥對于苗柱高度的影響效果顯著,但是對于根長和根數(shù)的影響效果卻不是很明顯;香蕉泥對于根長的影響效果非常明顯,但是對于根數(shù)以及苗柱高度的影響卻不是很明顯。綜上所述,鐵皮石斛莖段原球莖的生根最佳培養(yǎng)基組合是馬鈴薯泥10%+1/2 MS+NAA 1 mg/L+香蕉泥10%。見表4、表5。

表3 不同處理因子對原球莖增殖和分化的簡單重復(fù)序列檢驗(yàn)分析(%)

表4 香蕉泥、馬鈴薯泥和NAA對于鐵皮石斛莖段原球莖生根的效果分析

表5 香蕉泥、馬鈴薯泥和NAA生根效果的簡單重復(fù)序列檢驗(yàn)分析

4 討論

組織培養(yǎng)過程中,通過SSR檢驗(yàn),最終發(fā)現(xiàn)6-BA和基本培養(yǎng)基為鐵皮石斛莖段原球莖誘導(dǎo)率帶來的影響更加突出,NAA各個(gè)水平間并沒有明顯的差異。1/2MS和MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)率的平均值分別可以達(dá)到17.20和28.40,二者結(jié)果相差不大,但是和VM誘導(dǎo)率平均值4.80比較,相差顯著;另外,濃度為4 mg/L的6-BA其誘導(dǎo)率均值結(jié)果為25.30,和1 mg/L的誘導(dǎo)率存在較大差異。說明不同的濃度在誘導(dǎo)鐵皮石斛莖段原球莖的培養(yǎng)方面產(chǎn)生非常大的差異,需要嚴(yán)格取樣來誘導(dǎo)培養(yǎng)。在組織培養(yǎng)過程中,香蕉和馬鈴薯作為添加物放置到培養(yǎng)基中,暫時(shí)無法判斷產(chǎn)生的物質(zhì)具體情況,但是可以實(shí)現(xiàn)對植物生長的促進(jìn)效果,與其他研究結(jié)果相似[11-13],認(rèn)為馬鈴薯對促進(jìn)苗生長有積極作用[14-15],香蕉乳對鐵皮石斛的生根也帶來積極影響,二者共同作用下,可以提高鐵皮石斛的生長[16],有研究表明香蕉提取液可以作為培養(yǎng)基的緩沖劑,通過控制培養(yǎng)基的pH值,來進(jìn)一步誘導(dǎo)生根[17-18]。

鐵皮石斛的產(chǎn)地、種類,培養(yǎng)過程中的溫度、光照強(qiáng)度、時(shí)間等都對誘導(dǎo)腋芽產(chǎn)生差異的效果[19-21]。本研究中通過控制培養(yǎng)環(huán)境,提高研究的科學(xué)性,研究中對于試驗(yàn)所需條件也應(yīng)該給予嚴(yán)格的規(guī)定,各個(gè)培養(yǎng)階段的光照時(shí)間應(yīng)該滿足12 h/d,培養(yǎng)室內(nèi)部的溫度也應(yīng)該保持在(27±2)℃,內(nèi)部光照強(qiáng)度也要維持在4 000～5 000 lx。同時(shí),沒有添加激素的情況下,有利于建立基本培養(yǎng)基及添加物對研究樣本的實(shí)驗(yàn)條件。在原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化過程中,植物激素的作用顯而易見,一般情況下高濃度的細(xì)胞分裂素有利于誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生,而低濃度的生長素有利于根的形成,但是不同濃度的激素對芽、根產(chǎn)生異常影響,不利于后續(xù)鐵皮石斛的各種藥物機(jī)制和增殖研究。因此,本研究探討了不添加激素的情況下,鐵皮石斛的誘導(dǎo)、增殖和分化研究。在鐵皮石斛莖段原球莖的組織培養(yǎng)過程中,原球莖的分化屬于至關(guān)重要的一環(huán),其分化效果對控制組培過程化的生產(chǎn)投入有著十分重要的意義。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),通過配合使用生長素與特定濃度的細(xì)胞分裂素,可以有效改善鐵皮石斛原球莖分化效果,但是對于濃度有嚴(yán)格的要求,過高或者過低都不利于其分化。由于鐵皮石斛的組織培養(yǎng)周期較長,不同階段的培養(yǎng)基需要有不同的成分和條件,增殖與分化所用的培養(yǎng)基差異化也對鐵皮石斛莖段生芽到生根產(chǎn)生影響,本研究結(jié)果顯示,最適宜誘導(dǎo)鐵皮石斛莖段原球莖的培養(yǎng)基組合是NAA 0.10 mg/L+1/2MS+6-BA 4 mg/L,鐵皮石斛莖段原球莖增殖最佳的培養(yǎng)基是:MS+蔗糖30 g/L;分化的最佳培養(yǎng)基是:馬鈴薯泥10%+蔗糖10 g/L+1/2 MS。鐵皮石斛莖段原球莖的生根最佳培養(yǎng)基組合是馬鈴薯泥10%+1/2MS+NAA 1 mg/L+香蕉泥10%,3個(gè)不同階段的培養(yǎng)基要求不一樣。同時(shí)在培養(yǎng)的過程中對于激素的使用也會引起種苗產(chǎn)生變異。本研究所進(jìn)行的試驗(yàn)在沒有添加激素的前提下,基于正交試驗(yàn)方式發(fā)現(xiàn)變化蔗糖含量和基本培養(yǎng)基能夠?qū)﹁F皮石斛莖段原球莖增殖和分化效果進(jìn)行調(diào)節(jié),并找出了最理想的組合模式。