明膠與甜菜果膠的相互作用

李玉輝，章軼鋒，謝晶晶，張 露，方亞鵬

（湖北工業(yè)大學食品與制藥工程學院，湖北 武漢 430068）

明膠與甜菜果膠的相互作用

李玉輝，章軼鋒，謝晶晶，張 露，方亞鵬*

（湖北工業(yè)大學食品與制藥工程學院，湖北 武漢 430068）

研究明膠與甜菜果膠形成的復(fù)合物受pH值和混合比例的影響。甜菜果膠與明膠總質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL時，在兩者一定的混合比例下，添加葡萄糖酸內(nèi)酯進行酸化，利用紫外-可見分光光度計、激光納米粒度及電位滴定分析儀，測定體系的濁度、散射光強和流體力學半徑。通過尋找特征pH值，確定相邊界，進而構(gòu)建體系的pH值-混合比率相圖。結(jié)果表明：明膠與甜菜果膠混合物在酸化過程中，在高pH值區(qū)域無相互作用，隨后形成分子內(nèi)可溶性 復(fù)合物，進一步酸化形成分子間可溶性復(fù)合物，在低pH值區(qū)域為不可溶性復(fù)合物，體系逐漸失穩(wěn)。

甜菜果膠；明膠；相互作用；復(fù)合物；相圖

蛋白質(zhì)和多糖是食品體系中兩類重要生物大分子，是影響食品質(zhì)構(gòu)的主要因素。食品體系的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)是與蛋白質(zhì)-多糖之間的相互作用有關(guān)，而不僅僅依賴于單個生物大分子的功能性[1]。在加工過程中，各種成分的固有性質(zhì)以及它們之間的相互作用決定著食品的結(jié)構(gòu)、質(zhì)地和穩(wěn)定性[2]。大多數(shù)情況下，高分子在溶液中相互混合是不穩(wěn)定的，容易發(fā)生相分離[3]，攜帶相反電荷的兩種物質(zhì)通過靜電吸引結(jié)合在一起形成可溶性或不溶性的復(fù)合物[4]。

Tolstoguzov[5]將大分子相互作用分為3種類型：帶電的大分子之間的相互作用、帶相反電荷基團（酸 性和堿性）分子之間的相互作用、離子之間的相互作用。蛋白質(zhì)與非離子型多糖或陰離子多糖與pH值在等點電以上的蛋白質(zhì)混合物之間可以產(chǎn)生排斥力。在低離子強度下，帶正電荷的蛋白質(zhì)（pH＜pI）與陰離子多糖可以產(chǎn)生強的吸引力，不帶電或帶負電的蛋白質(zhì)（pH＞pI）和陰離子多糖產(chǎn)生弱的相互作用力。然而，在某些情況下仍然可以形成復(fù)合物，因為蛋白質(zhì)基團上存在正電荷區(qū)域[6]。在所有的作用力當中，靜電吸引力是最普遍的，包括帶電分子間形成的復(fù)合物[7]。

蛋白質(zhì)-多糖組合是研究復(fù)合凝聚作用的常用模型。一般認為，蛋白質(zhì)與多糖之間的復(fù)合不是由單一的某種作用完成的，而是靜電作用力、氫鍵、疏水相互作用、范德華力、離子鍵、容積排阻作用等共同作用的結(jié)果。在這些作用力中，靜電引力存在最為廣泛。蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物形成的相互作用力首次被Tiebackx[8]提出來，他認為明膠與阿拉伯膠形成復(fù)合物的穩(wěn)定性取決于添加到復(fù)合物溶液中酸的數(shù)目，所以，Tiebackx推測這與兩種高分子之間作用力的性質(zhì)有關(guān)。同樣，Bungenberg[9]論證了不溶性復(fù)合物的形成與特定的pH值和離子強度有關(guān)。據(jù)報道，白蛋白與不同類型淀粉分子（玉米、馬鈴薯、大米）之間的相容性與pH值影響有關(guān)。不溶性復(fù)合物達到的最大量需要特定的酸堿值[10]。蛋白質(zhì)與生物大分子的比例是復(fù)合物形成過程中一個重要影響因素。對每一個體系而言，產(chǎn)生最大絮凝量其分子比例是特定的。研究發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白和阿拉伯膠在總質(zhì)量濃度為1 g/100 mL，通過濁度測量，產(chǎn)生最大絮凝量的質(zhì)量比為4∶1。在溶液中，蛋白質(zhì)或多糖過量時，不會產(chǎn)生絮凝。生物聚合物濃度比較高時，體系由于熱力學不相容性會發(fā)生相分離[5]。

甜菜渣中含有豐富的果膠資源，含量占其干質(zhì)量的19.6%[11]，具有較大的開發(fā)利用價值。甜菜果膠是從甜菜榨糖后殘余的甜菜渣中提取而來的新型果膠，其側(cè)鏈上含有較高成分的乙?；?，無凝膠性[12]。甜菜果膠含有阿魏酸基團[13-16]，約占中性糖殘基含量的0.61%～2.5%[17]，因此又賦予其較強的乳化性[18-19]，是一種良好的食品添加劑，可以作為微膠囊的壁材[20-22]。明膠是由膠原蛋白經(jīng)過水解得到的一種天然高分子材料，在照相、制藥、食品、化妝品和膠黏劑等行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用[23-24]。根據(jù)明膠制備方法的不同，可以分為A型明膠（酸法水解）和B型明膠（堿法水解）。A型明膠是用酸水解豬皮、牛皮、牛骨等動物膠原得到的，其等電點在6～8之間，可塑性和彈性較好。而B型明膠是將動物的骨和皮等通過堿法水解處理得到的，其等電點在4.7～5.3之間，硬度較好[25]。

明膠-阿拉伯膠復(fù)合凝聚物被廣泛應(yīng)用于微膠囊化技術(shù)。此后，乳清蛋白、植物蛋白、低甲氧基果膠以及黃原膠等體系也陸續(xù)進入人們的視線。盡管利用復(fù)合凝聚現(xiàn)象制備微膠囊的研究時間較長，但其在現(xiàn)代食品加工中的應(yīng)用尚處于起步階段。本實驗利用甜菜果膠代替阿拉伯膠，解決阿拉伯膠供應(yīng)鏈不穩(wěn)定的問題，降低應(yīng)用成本。選擇明膠-甜菜果膠體系作為研究對象，在不同的蛋白質(zhì)-多糖配比及pH值條件下，通過相圖的構(gòu)建探討其相互作用機理，為明膠與甜菜果膠復(fù)合作為壁材進行微膠囊化提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

B型明膠（Mw1.945×105u）、葡萄糖酸內(nèi)酯 美國Sigma公司；甜菜果膠（Mw2.263×106u） 日本三榮源公司；氫氧化鈉、鹽酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SRT-202滾軸式混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；XH-B旋渦混合器 江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；Direct Q3純水機 美國Merck Millipore公司；ORION 4 STAR pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GL-21M智能高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；Zetasizer Nano-ZS納米粒度、電位滴定分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；BT-1600圖像顆粒分析系統(tǒng) 丹東百特科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 明膠與甜菜果膠混合物的制備

分別取適量的明膠和甜菜果膠粉末溶解在去離子水中（加入0.005 g/100 mL疊氮化鈉），配成質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL的溶液，置于滾軸混合器上，在室溫下混合搖勻12 h，使其充分溶解。將明膠溶液置于50℃水浴中，使其充分溶脹。明膠、甜菜果膠分別經(jīng)過冷凍離心（10 000 r/min，50 min），取上清液，用0.45 μm過濾膜過濾。取過濾后的溶液大約5 g，放入105℃烘箱中恒質(zhì)量。明膠與甜菜果膠按照一定的比例，配成總質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL混合物，初始pH值調(diào)為8.0，混合30 min備用。

1.3.2 在線pH值測定

采用Orion 4 Star pH計對葡萄糖酸內(nèi)酯酸化過程中的混合物的pH值進行連續(xù)監(jiān)控，在25℃恒溫條件下，先將pH計在4.01、7.00和10.01值處進行三點校正，pH值測定的精確度為0.01 pH單位，通過pH-時間曲線表征酸化過程。

1.3.3 膠粒的電位（ξ）測定

酸化過程中體系ξ的變化可以反映體系中明膠與甜菜果膠的相互作用，最終ξ值的大小可以用來衡量體系的穩(wěn)定性。

按照1.3.1節(jié)的方法，配制不同比例的明膠-甜菜果膠混合體系，分別稱取10 g，利用Nano ZS激光納米粒度及電位滴定分析儀（MPT-2自動滴定單元）進行連續(xù)滴定，采用NaOH（0.25 mol/L）和HCl（0.025、0.25 mol/L）溶液，使體系pH值從8.0逐步降到2.0以下，以pH值為橫坐標，ξ為縱坐標繪制電位滴定曲線，測定溫度為25℃。所用He-Ne激光光源輸出功率為4 mW，檢測角為17°，檢測波長為633 nm。

1.3.4 濁度的測定

配制不同比例的明膠-甜菜果膠混合體系，分別稱取10 g，添加適量的葡萄糖酸內(nèi)酯，混合均勻后，在25℃條件下，用TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計于500 nm波長處測定吸光度，監(jiān)測吸光度隨時間的變化，以蒸餾水為對照。

1.3.5 散射光強和流體力學半徑的測定

配制一系列不同比例的明膠-甜菜果膠混合體系，分別稱取10 g，添加適量的葡萄糖酸內(nèi)酯，混合均勻后，用Nano ZS激光納米粒度及電位滴定分析儀測定酸化過程中隨時間的變化體系的光散射強度和流體力學半徑。所用He-Ne激光光源輸出功率為4 mW，檢測角為173°，檢測波長為633 nm，在25℃條件下測定。

1.3.6 光學顯微鏡觀察

配制明膠-甜菜果膠（質(zhì)量比1∶1）混合物，稱取10 g，添加適量的葡萄糖酸內(nèi)酯，混合均勻后，在25℃條件下，每隔30 min用吸管吸取少量混合液置于載玻片上，用BT-1600圖像顆粒分布系統(tǒng)監(jiān)測液滴的形態(tài)變化，放大倍數(shù)為10倍。該系統(tǒng)由光學顯微鏡（Nikon YS100）、數(shù)字CCD攝像頭（HV2001UC）、圖像處理與分析軟件等部分組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖酸內(nèi)酯水解酸化

圖1 明膠-甜菜果膠（質(zhì)量比11∶1）混合物pH值隨酸化時間的變化Fig.1 Change in pH of gelatin-SBP (1∶1) as the change of acidification time

圖1為添加0.5 g/100 mL葡萄糖酸內(nèi)酯后，混合質(zhì)量比為1∶1的明膠-甜菜果膠體系的pH值隨時間的變化曲線。葡萄糖酸內(nèi)酯遇水發(fā)生水解后釋放出葡萄糖酸，使體系的pH值不斷降低，直至趨于穩(wěn)定。添加葡萄糖酸內(nèi)酯后，混合物初始pH值迅速降低，隨后緩慢下降，在200 min左右，pH值達到2.7左右，基本趨于穩(wěn)定不變。

2.2 ξ的測定

圖2 明膠-甜菜果膠混合物ξ隨pHH值的變化Fig.2 Change in ξ-potential of gelatin-SBP mixtures as the change of pH

在明膠-甜菜果膠的不同混合比例條件下，體系ξ隨pH值變化如圖2所示。總質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL，純明膠溶液的等電點為4.79，與文獻報道的結(jié)果一致[26]。純甜菜果膠溶液，pH值在5.0以上時，ξ在－40 mV左右，pH值在2.0以下時，ξ趨于0。甜菜果膠在葡萄糖酸內(nèi)酯的水解酸化下，羧基被質(zhì)子化，分子所帶電荷逐漸被中和?；旌象w系在酸化過程中，ξ在－40～25 mV之間，呈“S”形。隨著pH值的降低，ξ先緩慢增加，pH值在4.5～3.0范圍內(nèi)，ξ迅速增加，隨后ξ為正值。當pH＜2.6時，ξ變化趨于平穩(wěn)。隨著明膠-甜菜果膠比例的降低，混合物等電點逐漸降低。

2.3 濁度和散射光強的測定

在明膠-甜菜果膠分散體系中，由pH值誘導(dǎo)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變點可以采用互補法測定，比如散射光強和濁度。由于光散射對于分子水平上的結(jié)構(gòu)變化比較敏感，而濁度對于相對較大的顆粒（如微米級別）比較敏感，因此可以綜合光散射和濁度的變化趨勢來反映不尺寸的多糖-蛋白質(zhì)分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)形成，如可溶性分子復(fù)合物和不溶性分子復(fù)合物的形成[27-28]。

圖3 明膠-甜菜果膠混合物的散射光強度隨pH值的變化Fig.3 Light scattering intensity as a function of pH in gelatin- SBP mixtures

圖4 明膠-甜菜果膠混合物的濁度隨pH值的變化Fig.4 Turbidity as a function of pH in gelatin -SBP mixtures

由圖3、4可知，在pH值降低的初期，溶液的散射光強與濁度基本不變。隨著葡萄糖酸內(nèi)酯的水解酸化，pH值逐漸降低，散射光強先開始緩慢增加，可溶性復(fù)合物形成，隨后濁度才開始增加，不可溶性復(fù)合物開始形成。由于分子間作用力比較弱，所形成的可溶性復(fù)合物比較小，散射光強對分子水平的小顆粒敏感程度高于濁度，所以散射光強先開始增加，隨后濁度才開始增加當r=1時，散射光強在pH 4.8左右時開始上升，而濁度在pH 4.2左右才開始增加。隨著葡萄糖酸內(nèi)酯的進一步水解酸化，散射光強在pH 3.7左右時達到最大，而濁度在pH 3.3左右時才達到最大，隨后開始降低，原因是由于分子間作用力加強，顆粒尺寸增大，顆粒數(shù)量減少。

該實驗的結(jié)果還顯示，隨著明膠-甜菜果膠混合比例的變化，混合溶液達到最大的散射光強和濁度所對應(yīng)的pH值也在變化。同ξ變化趨勢一樣，隨著明膠-甜菜果膠比例的降低，散射光強和濁度達到的最大值所對應(yīng)的pH值也逐漸降低，這可能是由于隨著甜菜果膠質(zhì)量的增加，所帶負電荷隨之增加，就需要明膠攜帶更多的正電荷來中和，所需pH值也就逐漸降低。

2.4 pH值誘導(dǎo)復(fù)合物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變點的確定及其相圖的構(gòu)建

圖5 明膠-甜菜果膠混合物散射光強度（I117733°）、濁度（τ）、流體力學半徑（Rh）隨pH值的變化情況Fig.5 Change in turbidity (τ), light scattering intensity at (I117733°), and hydrodynamic radius (Rh) as the change of pH in gelatin-SBP mixtures

圖6 明膠-甜菜果膠混合物相圖Fig.6 Phase diagram of gelatin-SBP system

影響蛋白質(zhì)與多糖相互作用的因素比較多，如pH值、蛋白質(zhì)與多糖的比例、溶液體系質(zhì)量濃度等，其中pH值起著關(guān)鍵的作用。兩個比較重要的參數(shù)就是pHc和pHφ。pHc表示混合體系相互作用開始發(fā)生，散射光強緩慢增加，可溶性復(fù)合物開始形成，pHφ表示混合體系散射光強達到最大，濁度顯著增加，不可溶性復(fù)合物開始形成[27-28]。以r=1為例，明膠/甜菜果膠混合物散射光強、濁度、流體力學半徑隨pH值變化，確定pH值關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點，經(jīng)歸一化處理，結(jié)果如圖5所示。根據(jù)不同明膠/甜菜果膠混合比例下pHc、pHφ和明膠等電點（pI）繪制相圖，如圖6所示。結(jié)合圖2、5、6可以看出：（Ⅰ）當pH值高于明膠等電點（pI 4.79）時，甜菜果膠的ξ＜－32 mV，甜菜果膠與所帶負電荷的明膠產(chǎn)生靜電排斥作用，阻止彼此靠近，體系以單個高分子存在而無復(fù)合物形成；（Ⅱ）pH值介于pI與pHc時，在低比例條件下，少量明膠會絡(luò)合到甜菜果膠上，發(fā)生了分子內(nèi)局部相互作用，但ξ＜－30 mV，甜菜果膠之間仍以排斥力為主，體系仍然相對穩(wěn)定，此時發(fā)生分子內(nèi)相互作用；（Ⅲ）pH值介于pHc與pHφ時，甜菜果膠與明膠作用力加強，甜菜果膠分子上面絡(luò)合的明膠逐漸增加，甜菜果膠分子間短程吸引力可以克服遠程排斥力，發(fā)生分子間相互作用。體系混合物的ξ處于－25～－15 mV之間，此時不足以保證溶液具有完全的穩(wěn)定性，處于亞穩(wěn)定狀態(tài)[29]；（Ⅳ）當pH值低于pHφ時，明膠所帶正電荷逐漸增加，甜菜果膠與明膠間吸引力進一步加強，甜菜果膠上面絡(luò)合的明膠迅速增加，混合物ξ大于－10 mV，處于極不穩(wěn)定狀態(tài)，濁度顯著升高，流體力學半徑開始迅速增加，顆粒明顯增大，此時溶液顆粒相互聚集。

2.5 光學顯微鏡觀察

圖7 不同pH值的明膠-甜菜果膠混合物光學顯微觀察Fig.7 Optical microscopic images of gelatin-SBP mixtures at different pH levels

光學顯微鏡是一種研究復(fù)合物結(jié)構(gòu)的重要工具，可以監(jiān)測復(fù)合物形成過程中顆粒的不同形態(tài)和聚狀態(tài)。明膠-甜菜果膠混合物總質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL，混合質(zhì)量比為1∶1，在葡萄糖酸內(nèi)酯緩慢酸化后，不同pH值條件下溶液聚集狀態(tài)如圖7所示。結(jié)合圖6、7可知，當pH值處在相圖區(qū)域（Ⅲ）pH 4.2（圖7A）時，為分子間可溶性復(fù)合物區(qū)；當pH值到達pH 3.8（圖7B）時，此時體系為亞穩(wěn)定狀態(tài)，出現(xiàn)少數(shù)不溶性復(fù)合物顆粒；當pH值降到pH 3.72（圖7C）時，不溶性復(fù)合物顆粒數(shù)量逐漸增多，此時散射光強達到最大，濁度顯著增加；隨著葡萄糖酸內(nèi)酯的進一步酸化，pH值由pH 3.5（圖7D）降到pH 3.23（圖7E）時，流體力學半徑顯著升高，顆粒分子尺寸迅速增大，小顆粒聚集成大顆粒，顆粒數(shù)量不斷降低，到pH 3.23時濁度達到最大；當體系的pH值進一步降低到pH 2.8（圖7F）時，分子間作用力逐漸增加，顆粒間不斷聚集，當達到一定程度，在自身重力作用下，從體系中析出。

3 結(jié) 論

由于蛋白質(zhì)和多糖的復(fù)合凝聚驅(qū)動力主要是來自靜電相互作用，所以影響這種靜電相互作用的物理化學參數(shù)（如pH值、離子強度、多糖的電荷密度、多糖質(zhì)量濃度、多糖與蛋白質(zhì)的比例等）會極大地影響復(fù)合物的形成。在復(fù)合物形成過程中，pH值起著關(guān)鍵作用，因為它影響著生物大分子功能基團的解離度（即氨基和羧基）。由于這個原因，在明膠與甜菜果膠混合物中，pH值在明膠等電點（pI=4.79）以下時，兩個生物大分子帶有相反電荷，可以發(fā)生不同程度的相互作用。實驗發(fā)現(xiàn)：明膠/甜菜果膠混合物，在pH＞pI時，為高分子可溶物區(qū)；在pI＜pH＜pHc時，為分子內(nèi)可溶性復(fù)合物；在pHc＜pH＜pHφ時，為分子間可溶性復(fù)合物；在pH＜pHφ時，為不穩(wěn)定區(qū)。

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[29] SIPOSOVA K, KUBOVCIKOVA M, BEDNARIKOVA Z, et al. Depolymerization of insulin amyloid fibrils by albuminmodified magneticfluid[J]. Nanotechnology, 2012, 23(5): 5101. doi:10.1088/0957-4484/23/5/055101.

Interaction between Gelatin and Sugar Beet Pectin

LI Yu-hui, ZHANG Yi-feng, XIE Jing-jing, ZHANG Lu, FANG Ya-peng*
(School of Food and Pharmaceutical Engineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

Factors such as pH and mixing ratio for influencing the complex of sugar beet pectin and gelatin were studied. The total concentration of sugar beet pectin and gelatin was fixed at 0.1 g/100 mL. At a certain mixing ratio, the mixed system was acidified by gluconolactone, and the turbidity, light scattering intensity and hydrodynamic radius of the system were determined. Through exploring featured pHs, the phase boundaries were determined and a pH-composition phase diagram was established. The turbidity was measured using UV-Vis spectrophotometer, and light scattering intensity and hydrodynamic radius were tested using Zetasizer Nano-ZS apparatus. Based on the phase diagram and microscopic observation, no interaction was found between sugar beet pectin and gelatin at higher pH levels, while intramolecular and subsequently intermolecular soluble complexes were formed due to further acidification. At low pH levels, insoluble molecular complexes were developed and the system became unstable.

sugar beet pectin; gelatin; interaction; complex; phase diagram

TS201.7

A

1002-6630(2014)01-0029-05

10.7506/spkx1002-6630-201401006

2012-12-17

國家自然科學基金項目（31171751；31101260）；教育部科學技術(shù)研究重點項目（212117）；武漢市科技局科技攻關(guān)計劃項目（201120822280）；湖北省自然科學基金杰出青年人才項目（2012FFA004）

李玉輝（1987—），男，碩士，研究方向為食品科學與工程。E-mail：lyh061525@163.com

*通信作者：方亞鵬（1977—），男，教授，博士，研究方向為食品天然高分子與膠體。E-mail：y.fang@glyndwr.ac.uk