黑靈芝多糖對S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞cAMP/PKA、IP3/Ca2+及DAG/PKC信號通路的影響

黃建琴，聶少平*，張莘莘，黃丹菲，朱科學，謝明勇

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

靈芝（Ganoderma lucidum）為擔子菌綱多孔菌科靈芝菌屬的藥食兩用高等真菌，是我國最具有研究價值的著名藥用真菌之一，也是一種新資源食品[1]。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，大量實驗證明，靈芝多糖具有免疫增強和抗腫瘤作用[2-4]。黑靈芝又為靈芝中的極品，對人體保健具有的藥用療效遠高于其他種類的靈芝[5]。

眾所周知，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫密切相關。目前，國內(nèi)外大量研究表明靈芝多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性[6-7]。實驗證明，黑靈芝多糖（polysaccharides fromGanoderma atrum，PSG-1）對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞無直接抑制作用，也不能誘導腫瘤細胞凋亡，但對體內(nèi)腫瘤有明顯的抑制作用[8]。但黑靈芝多糖抗腫瘤作用的確切機制，尤其是對巨噬細胞、NK細胞等的信號轉(zhuǎn)導過程有何影響尚不清楚[9]。本實驗利用腹水瘤S-180細胞建立荷瘤小鼠模型，收集S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞，探討黑靈芝多糖對S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/細胞蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)/Ca2+及甘油二酯（diacylglycerol，DAG）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）信號通路的影響，進而確定PSG-1對荷瘤小鼠巨噬細胞的激活作用，為研究PSG-1抗腫瘤分子機制提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑靈芝（Ganoderma atrum）采自江西贛南靈芝生產(chǎn)基地，PSG-1由本實驗制備，其純度＞99.8%。采用紅外光譜法、氣相色譜法、分子大小排阻色譜法、氨基酸分析儀以及高效液相色譜法測得該多糖主要由甘露糖、半乳糖以及葡萄糖組成，其物質(zhì)的量的比為1∶1.28∶4.91，平均分子質(zhì)量為1013kD[10]。

RPMI-1640培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清 美國HyClone公司；脂多糖 美國Sigma公司；小鼠IP3、DAG和cAMP ELISA試劑盒 上海西唐有限公司；鈣離子熒光探針試劑盒 碧云天生物技術研究所；Anti-PKA、Anti-PKC抗體 美國Abcam公司；Antiβ-actin辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG 北京中杉金橋生物技術有限公司。

電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；CO2培養(yǎng)箱、VARIOSKAN FLASH酶標儀 美國Thermo公司；超凈工作臺 吳江市凈化設備總廠；3K15-高速冷凍離心機 美國Sigma公司；高壓滅菌裝備 上海醫(yī)療器械廠。

1.2 細胞及動物

腹水瘤S-180細胞株，購于中國科學院上海細胞庫。

BALB/c清潔級小鼠30只，雌性，體質(zhì)量（22±2）g，購自南昌大學醫(yī)學院動物房。

1.3 方法

1.3.1 動物的造模

用PBS將無菌收集的S-180細胞懸液濃度調(diào)節(jié)至1×106個/mL，用1mL一次性無菌注射器每只0.2mL接種于小鼠右肢腹溝處。靜養(yǎng)約1周后小鼠右肢處出現(xiàn)腫瘤塊，造模成功。

1.3.2 腹腔巨噬細胞的分離純化

造模成功后繼續(xù)靜養(yǎng)1周，待腫瘤塊如黃豆大小，取S-180荷瘤小鼠頸椎脫臼處死，放入碘伏3min，75%酒精中浸泡3min脫碘，用無菌注射器向腹腔注入5mL預冷的PBS緩沖液，用棉球輕柔腹部1～2min后吸取腹腔液于離心管中，重復沖洗腹腔3次，收集以上PBS，于1000r/min離心5min，棄上清沉淀物。再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸沉淀物并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱（5% CO2、37℃）培養(yǎng)4h后，輕輕吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗去未貼壁細胞，重復洗滌3次，即可得到純化的腹腔巨噬細胞[11-13]。

1.3.3 荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞上清液中IP3、DAG和cAMP含量的測定

按上述方法制備的S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞懸液，臺盼藍拒染檢測其活性（＞95%），分別按每孔4×105個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，補充培養(yǎng)液至200μL，在細胞中加入PSG-1使其終質(zhì)量濃度為20、40、80、160μg/mL，每組設5個復孔。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，收集上清。采用夾心ELISA法測定IP3、DAG和cAMP含量，具體操作方法按照相應的試劑盒說明進行。

1.3.4 荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)Ca2+含量測定

取腹腔巨噬細胞懸液按1×105個/mL細胞濃度接種于6孔板中，不同質(zhì)量濃度PSG-1刺激24h后，收集細胞，參照Fluo-3 AM（鈣離子熒光探針）試劑盒說明處理收集的巨噬細胞，室溫下用PBS清洗細胞，再100μL PBS重懸細胞后避光保存，在流式細胞儀上檢測胞內(nèi)鈣離子含量。

1.3.5 荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞PKA及PKC表達水平的測定

取不同質(zhì)量濃度的PSG-1作用荷瘤小鼠巨噬細胞24h后，收集細胞，參照總蛋白提取試劑盒說明收集各組的蛋白，并用BCA法檢測蛋白含量。用Western blotting法測定PKA及PKC的表達量。在上樣緩沖液中煮沸5min進行變性，然后將每個樣品裝載到10%的SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%奶粉在室溫下封閉1h，用一抗即抗PKA及抗PKC于4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗滌后，在室溫下用適當?shù)睦备^氧化物酶標記的羊抗兔抗體將膜孵育1h，再次洗滌后，用化學發(fā)光試劑覆蓋膜表面，ChemiDocXRS＋凝膠成像系統(tǒng)檢測PKA及PKC表達水平。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 PSG-1對S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IP3、DAG和cAMP的影響

由表1可見，PSG-1在終質(zhì)量濃度20～160μg/mL范圍內(nèi)作用24h后可促進S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞生成IP3、DAG和cAMP，并顯著高于模型對照組，呈一定的劑量相關性。

表1 PSG-1對荷瘤小鼠脾腹腔巨噬細胞產(chǎn)生cAMP、DAG及IP3的影響lTable 1 Effects of PSG-1 on cAMP, DAG and IP production in peritoneal macrophages of tumor-bearing mice

2.2 PSG-1對S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)Ca2+含量的影響

細胞內(nèi)游離Ca2+是細胞內(nèi)重要的信使，其主要貯存于胞內(nèi)鈣庫（如肌細胞的肌漿網(wǎng)）和線粒體中。為了檢測PSG-1是否影響巨噬細胞內(nèi)Ca2+濃度，用PSG-1作用荷瘤小鼠巨噬細胞24h后，流式細胞儀測定細胞內(nèi)Ca2+含量。由圖1可知，與模型對照組相比PSG-1刺激后S-180荷瘤小鼠巨噬細胞內(nèi)Ca2+濃度顯著增加，并呈劑量依賴性增強。其濃度依賴性關系如圖2所示。

圖1 PSG-1對荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞Ca2+濃度的影響Fig.1 Effects of PSG-1 on Ca2+ flux in peritoneal macrophages of tumorbearing mice

圖2 荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞Ca2+濃度對應的比例Fig.2 The corresponding proportion of Ca2+ flux in peritoneal macrophages of tumor-bearing mice

2.3 PSG-1對S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)PKA及PKC表達水平的影響

PKA和PKC在受體介導的信號傳遞過程中起著重要作用。PKA又稱依賴于cAMP的蛋白激酶A，是一種結構最簡單、生化特性最清楚的蛋白激酶。一般認為，真核細胞內(nèi)幾乎所有的cAMP的作用都是通過活化PKA，從而使其底物蛋白發(fā)生磷酸化而實現(xiàn)的。PKC也是一種常見激酶，一般以非活性狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中。由圖3、4可知，隨著PSG-1質(zhì)量濃度的增加，PKA及PKC表達水平增強，與模型對照組比較均有顯著增加。

圖3 PSG-1對荷瘤小鼠脾腹腔巨噬細胞PKA及PKC表達水平的影響Fig.3 Effect of PSG-1 on the protein expression levels of PKA and PKC in peritoneal macrophages of tumor-bearing mice

圖4 PKA及PKC表達量對應的灰度值（n=33）Fig.4 The corresponding gray values of the protein expression levels of PKA and PKC (n = 3)

3 討 論

目前腫瘤是嚴重危害人類生命的疾病之一，對人類的健康有很大危害，其死亡率居高不下，尋找有效的預防和高效抗腫瘤藥物，仍然是科研工作者面臨的重要挑戰(zhàn)。大量研究表明，機體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系[14]。巨噬細胞是免疫效應細胞，具有多種免疫功能，包括免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)以及抗原呈遞等，在機體的免疫系統(tǒng)中起著重要作用。

早期研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated proteinkinases，MAPKs）區(qū)主要受酪氨酸激酶（tyrosine kinase，PKT）、PKC和PKA等激酶刺激活化[15]，而MAPK又參與多糖激活巨噬細胞免疫應答[16]。所以，PKA及PKC參與多糖巨噬細胞免疫應答。PKA被cAMP活化后，在ATP的存在下調(diào)節(jié)細胞的物質(zhì)代謝和基因表達，從而影響細胞的增殖和分化。PKC也在調(diào)節(jié)細胞增殖和改變細胞的離子通道方面發(fā)揮著重要的作用。研究表明，PKA和PKC介導的信號轉(zhuǎn)導途徑涉及到多種細胞的存活和增殖[17]。那么，PSG-1是否通過cAMP/PKA、IP3/Ca2+及DAG/PKC信號通路的活化作用于患病小鼠的腹腔巨噬細胞，從而改善患病小鼠的免疫能力，目前尚無報道，本實驗對此進行了探討。

cAMP是由腺苷酸環(huán)化酶催化ATP生成的；IP3和DAG由G-蛋白偶聯(lián)受體激活磷脂酶C生成IP3及DAG。DAG、IP3和cAMP是細胞內(nèi)常見的第二信使，參與激活細胞內(nèi)多個信號通路，引起級聯(lián)反應，進行細胞的應答。cAMP主要是通過蛋白脂磷酸化作用繼續(xù)傳遞信息，將代謝途徑中的一些靶蛋白中的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，將其激活或鈍化[18-19]。這些被共價修飾的靶蛋白往往是一些關鍵調(diào)節(jié)酶或重要功能蛋白，因而可以介導胞外信號，調(diào)節(jié)細胞反應。實驗結果表明，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞經(jīng)PSG-1處理后cAMP濃度顯著升高，同時PKA表達量也顯著增加。由此可以推斷，PSG-1可以激活荷瘤小鼠巨噬細胞內(nèi)cAMP/PKA信號通路。

IP3和DAG功能分別是開放胞內(nèi)鈣庫、激活Ca2+途徑和在Ca2+和磷脂酰絲氨酸存在下激活PKC。以肌醇磷脂代謝為基礎的細胞信號系統(tǒng)，最大的特點是胞外信號被膜受體接受后，同時產(chǎn)生兩個胞內(nèi)信使，分別激動兩個信號傳遞途徑即IP3/Ca2+和DAG/PKC途徑[20-21]。細胞信號轉(zhuǎn)導理論認為：IP3通過作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上特異的受體使其內(nèi)部Ca2+釋放，引起胞內(nèi)Ca2+水平的增加，從而啟動胞內(nèi)Ca2+信號系統(tǒng)，即通過依賴Ca2+、鈣結合蛋白的酶類活性變化來調(diào)節(jié)和控制一系列的生理過程。DAG通過激活PKC，以磷酸化的形式對許 多蛋白質(zhì)和酶類進行修飾，從而調(diào)節(jié)和控制另外一系列的生理過程。兩條途徑相輔相成，又互相約束。 同時兩條通路信號的強弱又可根據(jù)原始信號的不同特征在細胞內(nèi)加以調(diào)節(jié)，而使細胞對這些外界 信號作出不同的反應。實驗結果發(fā)現(xiàn)，在PSG-1刺激下，荷瘤小鼠巨噬細胞產(chǎn)生IP3和DAG量增加，且細胞內(nèi)Ca2+濃度及PKC表達量也顯著升高。由此可以說明，PSG-1可以啟動荷瘤小鼠巨噬細胞內(nèi)IP3/Ca2+和D AG/PKC途徑。該兩條途徑在信號轉(zhuǎn)導的過程中可能共同協(xié)作，進而激活荷瘤小鼠的腹腔巨噬細 胞，但需要進一步深入研究。

綜上所述，在相關研究表明PSG-1具有體內(nèi)抗腫瘤作用[8,22]及多糖對巨噬細胞 免疫應答作用的研究基礎上[16]，本實驗通過接種S-180于小鼠右腹股溝處建立荷瘤小鼠模型，無菌分離荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞用于研究PSG-1對細胞內(nèi)的信號通路的影響，為進一步研究PSG-1抗腫瘤機制提供參考。結果顯示，PSG-1可以激活荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)cAMP/PKA、IP3/Ca2+及DAG/PKC信號通路，從而使患病小鼠免疫細胞發(fā)生一系列抵抗腫瘤的反應。由此可以猜測，PSG-1通過作用于荷瘤小鼠巨噬細胞，激發(fā)細胞內(nèi)不同的信號通路，提高機體免疫能力從而實現(xiàn)抗腫瘤作用。針對得出的實驗結果，本實驗室將進一步研究細胞內(nèi)其他信號通路，最終確定PSG-1激活巨噬細胞的一系列通路。

[1]陳亞非, 陳金顯. 靈芝多糖免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用綜述[J]. 中國食品添加劑, 2002(4): 36-40.

[2]鄧海林, 吳佩穎, 王建新. 靈芝的研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2005,16(2): 141-143.

[3]趙世華, 姚文兵, 龐秀炳, 等. 靈芝多糖分離鑒定及抗腫瘤活性的研究[J]. 中國生化藥物雜志, 2003, 24(4): 173-176.

[4]李松, 吳青華, 陳暢, 等. 多糖抗腫瘤活性的最新研究進展[J]. 中國生化藥物雜志, 2007, 28(3): 213-215.

[5]弓曉峰. 黑靈芝元素形態(tài) , 活性成分及其保健功能研究[D]. 南昌: 南昌大學, 2006: 13-162.

[6]李文娟, 聶少平, 余強, 等. 黑靈芝多糖對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 食品科學, 2009, 30(19): 297-299.

[7]朱科學, 聶少平, 李文 娟, 等. 黑靈芝多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖及誘生細胞因子的影響[J]. 食品科學, 2010, 31(19): 351-354.

[8]ZHANG Shenshen, NIE Shaoping, HUANG Danfei, et al.Immunomodulatory effect ofGanoderma atrumpolysaccharide on CT26 tumor-bearing mice[J]. Food Chemistry, 2013, 136: 1213-1219.

[9]LIU Gaoqiang, ZHANG Kechang. Mechanisms of the anticancer action ofGanoderma lucidum(Leyss. ex Fr.) Karst.: a new understanding[J].Journal of Integrative Plant Biology, 2005, 47(2): 129-135.

[10]CHEN Yi, XIE Mingyong, NIE Shaoping, et al. Purification,compo sition analysis and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies ofGanoderma atrum[J]. Food Chemistry, 2008,107(1): 231-241.

[11]ZHANG Jingsong, TANG Qingjiu, ZHOU Changyan, et al. GLIS, a bioactive proteoglycan fraction fromGanoderma lucidum, displays anti-tumour activity by increasing both humoral and cellular immune response[J]. Life Sciences, 2010, 87(19): 628-637.

[12]尹美珍, 李世普, 袁琳, 等. 小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].武漢大學學報: 醫(yī)學版, 2006, 27(2): 203-205.

[13]李海濤, 肖丹, 屈學民, 等. 小鼠腹腔巨噬細胞的分離與培養(yǎng)[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2008, 8(4): 638-639.

[14]王統(tǒng)一, 趙兵, 王玉春. 多糖免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤研究進展[J]. 過程工程學報, 2006, 6(4): 674-682.

[15]YAMASHITA Y M, NAKASEKO Y, SAMEJIMA I, et al. 20S cyclosome complex formation and proteolytic activity inhibited by the cAMP/PKA pathway[J]. Nature, 1996, 384: 276-279.

[16]易陽, 曹銀, 張名位. 多糖調(diào)控巨噬細胞免疫應答機制的研究進展[J].中國細胞生物學學報, 2011, 33(11): 1267-1277.

[17]TANG Xinyan, ZHANG Caiqiao. Activation of protein kinases A and C promoted proliferation of chicken primordial germ cells[J]. Animal Reproduction Science, 2007, 101(3): 295-303.

[18]KOVO M, KANDI-COHEN M, BEN-HAIM M, et al. An active protein kinase A (PKA) is involved in meiotic arrest of rat growing oocytes[J]. Reproduction, 2006, 132(1): 33-43.

[19]SAZONOVA O V, BLISHCHENKO E Y, TOLMAZOVA A G, et al.Stimulation of fi broblast proliferation by neokyotorphin requires Ca2+influx and activation of PKA, CaMK II and MAPK/ERK[J]. FEBS Journal, 2007, 274(2): 474-484.

[20]VILLA I, dal FIUME C, MAESTRONI A, et al. Human osteoblastlike cell proliferation induced by calcitonin-related peptides involves PKC activity[J]. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 2003, 284(3): E627-E633.

[21]付志華, 李素平. TNF-α誘導心肌成纖維細胞增殖的信號轉(zhuǎn)導機制研究[J]. 中國醫(yī)療前沿, 2013, 8(2): 1-3.

[22]梁軍, 李予蓉, 孫紀元, 等. 靈芝-912 對小鼠移植性腫瘤的抑制作用[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志, 2003, 13(9): 11-13.