枸杞總多糖對2 型糖尿病大鼠的降糖作用研究

尹長江， 楊坤寶， 張學軍， 宋鴻儒

(承德醫(yī)學院，河北 承德067000)

枸杞Lycium chinense 是茄科枸杞屬的多分枝灌木植物。《本草綱目》記載:“春采枸杞葉，名天精草;夏采花，名長生草;秋采子，名枸杞子;冬采根，名地骨皮”。果實稱枸杞子，作為藥食兩用的原料，自古以來，中醫(yī)就將枸杞子作為補益肝腎及明目的中藥應用于臨床［1］。枸杞多糖是傳統(tǒng)中藥枸杞子的主要活性組分之一，現(xiàn)代藥理學研究表明其具有降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)機體免疫及抗氧化等多種生物學活性，具有良好的藥用開發(fā)價值［2-3］。本研究擬通過免疫學和形態(tài)學方法探討枸杞總多糖對2 型糖尿病大鼠糖代謝和胰島組織形態(tài)的影響，闡明枸杞總多糖對2 型糖尿病大鼠的降糖作用，旨在為綜合開發(fā)利用枸杞總多糖應用于2 型糖尿病的臨床防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 wistar 大鼠，雄性，體質(zhì)量(160 ±10)g，購自北京維通利華動物實驗中心，合格證號為SCXK (京)2010-0016?；A飼料、高脂高糖飼料均購自北京維通利華動物實驗中心，高脂高糖飼料配方為:15%蔗糖，10%豬油，1.5%膽固醇，1.0%膽酸鈉，63.5%基礎飼料。

1.1.2 藥物 寧夏枸杞子Lycium barbarum L. 的干燥成熟果實，購自河北承德市中藥材科技開發(fā)公司。枸杞總多糖由本實驗室從枸杞子中提取。具體方法為:將枸杞子60 ℃條件下烘干、研磨成粉，稱取50 g。經(jīng)石油醚回流脫脂-95%乙醇洗滌-熱水浸提多糖-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮沉淀得到粗提物-去蛋白-層析柱純化過濾得到精制多糖。多糖的回收率及成分測定采用苯酚—硫酸法［4］，檢測得到多糖的提取率為5.27%，多糖含有量為24.2%，產(chǎn)量和純度均較為理想，適用于藥理學實驗研究。

1.1.3 主要儀器 RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);層析柱(上海華美實驗儀器廠);UV-2100 紫外分光光度計(上海龍尼柯儀器有限公司);M-300 半自動生化分析儀(荷蘭威圖儀器科學公司);HH6003 γ-放射免疫分析儀(北京核海高技術開發(fā)公司);H-8100 透射電子顯微鏡(日本Hitachi 公司);E1000 型生物顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 方法

1.2.1 2 型糖尿病大鼠模型制備 大鼠適應性喂養(yǎng)一周后，給予高脂高糖飼料，喂養(yǎng)4 周后，禁食12 h，以40 mg/kg劑量腹腔注射STZ。繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)1 周后，禁食12 h，采用毛細玻璃管從大鼠內(nèi)眥靜脈取血1 mL，測定大鼠的空腹血糖，以空腹血糖≥7.8 mmol/L 作為判斷2 型糖尿病免疫模型造模成功的判斷標準。

1.2.2 實驗分組 隨機選取糖尿病模型大鼠40 只，均分為5 組:模型組，枸杞總多糖低劑量(100 mg/kg)、中劑量(200 mg/kg)、高劑量(400 mg/kg)干預組，格列苯脲干預組(即陽性藥物組，給藥劑量為5 mg/kg);另取基礎飼料喂養(yǎng)且體質(zhì)量相近的大鼠8 只作為正常對照組。其中3 個多糖干預組和格列苯脲干預組大鼠每天灌胃相應劑量的藥物(溶于0.9%生理鹽水)，而正常對照組和糖尿病免疫模型組大鼠則每天灌胃同等容積的0.9%生理鹽水，持續(xù)灌胃4 周。試驗過程中除正常對照組大鼠以基礎飼料喂養(yǎng)外，其余各組大鼠均喂以高脂高糖飼料。

1.2.3 血液相關指標測定 灌胃4 周后，各組大鼠禁食12 h，采用10 mg/mL 戊巴比妥鈉以45 mg/kg 劑量腹腔麻醉大鼠，從各組大鼠的腹主動脈取血5 mL，4 ℃下3 000 r/min離心10 min 分離血清和血漿，根據(jù)各試劑盒說明測定血液相關指標。血清中空腹胰島素(FINS)和C-肽采用放射免疫法測定;血糖(FBG)采用酶法測定;血漿中糖化血紅蛋白(HbA1c)采用糖化血紅蛋白分析儀測定。

1.2.4 胰腺組織HE 染色 取固定于10%中性甲醛溶液中的大鼠胰腺組織，依次經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明后行常規(guī)石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片，然后進行HE 染色，中性樹膠封片后，將切片置于光學顯微鏡下觀察胰腺組織形態(tài)。

1.2.5 胰腺組織超微結(jié)構(gòu)觀察 各組隨機取3 只大鼠，經(jīng)1 g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉后打開腹腔，迅速取少許胰腺尾部組織，經(jīng)2.5%戊二醛固定液前固定，1%鋨酸溶液后固定，50 nm 超薄切片，乙酸鉛和乙酸鈾電子染色后，透射電子顯微鏡觀察、攝片，觀察胰島細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計分析程序?qū)υ囼灁?shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間兩兩比較用LSD-t 檢驗，組間差異顯著性用方差分析法檢驗，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 枸杞總多糖對2 型糖尿病大鼠糖代謝相關指標的影響由表1 可以看出，經(jīng)LBP 干預治療后糖尿病大鼠的空腹血糖水平高于正常對照組，且在整個試驗過程中一直持續(xù)著高血糖狀態(tài)。而LBP 干預治療能夠顯著地降低糖尿病大鼠的血糖，且這種治療作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，尤其是LBP 高劑量干預組，與陽性對照藥物格列苯脲的治療效果相似。模型組大鼠的FINS、C-P 和HbA1c 水平均極顯著低于正常對照組大鼠，而LBP 干預組大鼠的FINS 和C-P水平明顯升高，HbA1c 水平則明顯降低且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。結(jié)果表明，枸杞總多糖的降血糖作用可能與其能促進糖尿病模型大鼠的胰島素分泌和釋放有關。

2.2 枸杞總多糖對2 型糖尿病大鼠胰腺組織形態(tài)的影響由圖1 可以看出，正常對照組大鼠胰腺中胰島組織與腺泡之間界限清晰，胰島細胞豐富，分布均勻，形態(tài)規(guī)則(圖1-A);而模型組大鼠胰島組織明顯萎縮，胰島與腺泡脫離，胰島細胞明顯減少，且部分細胞呈現(xiàn)出變性、核固縮現(xiàn)象(圖1-B);LBP (圖1-C ～E)和陽性藥物格列苯脲干預組(圖1-F)大鼠胰島組織形態(tài)明顯改善，尤其以LBP 高劑量干預組(圖1-E)和格列苯脲干預組的治療效果最為明顯，胰島細胞較多，排列整齊，組織形態(tài)基本恢復正常。結(jié)果表明，枸杞多糖對糖尿病大鼠的胰島組織具有明顯的保護作用。

表1 枸杞總多糖對2 型糖尿病大鼠FBG，F(xiàn)INS，C-P 和HbA1c 的影響(±s，n=8)

表1 枸杞總多糖對2 型糖尿病大鼠FBG，F(xiàn)INS，C-P 和HbA1c 的影響(±s，n=8)

注:與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 給藥劑量/(mg·kg -1) FBG/(mmol·L -1) FINS/(μIU·mL -1) C-P/(pmol·mL -1) HbA1c(μmol/L -1)正常對照組 - 4.56 ±0.43＊＊ 11.31 ±1.19＊＊ 0.36 ±0.03＊＊ 1.21 ±0.11＊＊模型組 - 12.59 ±1.13 4.76 ±0.52 0.12 ±0.01 2.49 ±0.26 LBP 低劑量干預組 100 9.26 ±0.89* 5.92 ±0.57* 0.17 ±0.01* 2.21 ±0.24*LBP 中劑量干預組 200 8.19 ±0.76＊＊ 7.92 ±0.72* 0.22 ±0.02* 2.01 ±0.21*LBP 高劑量干預組 400 6.76 ±0.59＊＊ 9.13 ±0.86＊＊ 0.28 ±0.03＊＊ 1.85 ±0.17*格列苯脲干預組 5 6.91 ±0.62＊＊ 9.21 ±0.89＊＊ 0.29 ±0.03＊＊ 1.87 ±0.17*

圖1 枸杞總多糖對2 型糖尿病大鼠胰腺組織形態(tài)的影響(×400)

2.3 枸杞總多糖對2 型糖尿病大鼠胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響各組大鼠胰腺超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果見圖2。由圖中可知，正常對照組大鼠胰島β 細胞胞核呈規(guī)則的卵圓形，染色質(zhì)均勻，核仁清晰，胞漿內(nèi)胰島素分泌顆粒豐富(圖2-A);而模型組大鼠胰島β 細胞胞核明顯固縮，核仁消失，染色質(zhì)邊集，胰島素分泌顆粒大量減少，電子密度較低(圖2-B);LBP低劑量干預組大鼠的細胞核也有固縮和染色質(zhì)邊集現(xiàn)象，分泌顆粒較少，但與模型組相比，各細胞器病理變化有所減輕(圖2-C);LBP 中劑量干預組大鼠的胰島細胞線粒體空泡與腫脹病變明顯好轉(zhuǎn)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒程度減輕(圖2-D);而LBP 高劑量干預組(圖2-E)和陽性藥物格列苯脲對照組大鼠(圖2-F)的胰島細胞超微結(jié)構(gòu)與正常對照組無明顯差異，胞核規(guī)則，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)結(jié)構(gòu)均接近于正常對照組。枸杞總多糖低、中、高3 個劑量組對2型糖尿病大鼠的胰島細胞超微結(jié)構(gòu)都有一定的改善作用，其中以400 mg/kg 時改善作用最為明顯。

3 討論

糖代謝紊亂是糖尿病的重要病理生理學基礎，是糖尿病患者血糖失衡的重要原因之一［5-6］。因此，調(diào)節(jié)糖代謝、維持血糖平衡是治療糖尿病的一個重要途徑［7-8］。目前普遍認為高脂高糖飲食聯(lián)合小劑量注射STZ 的方法誘導的糖尿病大鼠模型與人類的2 型糖尿病極為相似，其主要以血糖升高、胰島細胞功能受損以及免疫功能下降等為主要特征［9］。因此，本研究所建立的動物模型的發(fā)病機制和特征與2 型糖尿病患者的臨床發(fā)病過程和代謝特征較為相似，保證了糖尿病模型的可靠性，為枸杞總多糖藥理學研究提供了良好的動物模型。

圖2 枸杞總多糖對2 型糖尿病大鼠胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響

血糖升高和胰島素分泌減少是2 型糖尿病的主要特征，本研究采用高、中、低3 個劑量的枸杞總多糖干預治療糖尿病大鼠，結(jié)果表明，枸杞總多糖可有效控制糖尿病大鼠的血糖水平，提高其機體胰島素水平，該結(jié)果可作為枸杞總多糖降血糖的主要證據(jù)［10］。此外，血清中C 肽的增多也佐證了枸杞總多糖治療組大鼠機體內(nèi)胰島素分泌功能得到改善，進而促進了糖代謝，使血液中葡萄糖量顯著減少，進而緩解了糖尿病大鼠機體的高血糖狀態(tài)。體內(nèi)長期持續(xù)的高血糖狀態(tài)可通過氧化應激或非氧化應激反應等途徑誘發(fā)胰島細胞凋亡，導致細胞數(shù)量減少，胰島素分泌量降低［11-12］;另外，高血糖或游離脂肪酸所造成的氧化應激或非氧化應激損傷可導致胰島細胞合成和分泌胰島素的功能受損，單個細胞分泌的胰島素減少［13-14］。因此，如何保護胰島細胞，促進其合成與分泌胰島素是治療2 型糖尿病的又一關鍵所在。本研究中，2 型糖尿病大鼠的胰島組織形態(tài)結(jié)果表明，枸杞總多糖可有效地保護糖尿病大鼠胰島細胞，修復胰島組織損傷，進而促進胰島素的合成和分泌，這可能與其能降低糖尿病大鼠機體的氧化應激水平有關。綜上，枸杞總多糖可有效控制2 型糖尿病大鼠的空腹血糖水平，調(diào)節(jié)糖代謝，減輕糖尿病大鼠胰島β 細胞損傷，促進胰島β 細胞分泌胰島素，且枸杞總多糖對2 型糖尿病大鼠的治療作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

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