參黃膠囊對2 型糖尿病大鼠血脂及炎性因子的影響

吳知桂， 周德先， 陳美娟

(1. 瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 瀘州市646000;2. 瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 瀘州646000)

隨著人們對糖尿病的研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病其多方面的慢性并發(fā)癥，有較高的致殘率和致死率［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，糖尿病的慢性并發(fā)癥可高達100 種以上。這些慢性并發(fā)癥主要累及微血管和大血管，涉及范圍廣，發(fā)病率高。2 型糖尿病體內(nèi)存在代謝紊亂綜合征:血糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、胰島素升高，代謝紊亂會加重胰島素抵抗，同時通過脂中毒、炎性因子的刺激等一系列途徑導(dǎo)致慢性并發(fā)癥，尤其是炎性因子與2 型糖尿病有著密切的關(guān)系［2］。所以對2 型糖尿病的治療降糖是基本點，進一步通過降脂及抗炎可防治慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。

材料與方法

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗對象 健康成年SD 雄性大鼠，體質(zhì)量(200 ±20)g，鼠齡5 ～7 月(由第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供)，SPF 級合格動物，合格證號:SCXK (渝)2007-0005。

1.2 主要的實驗藥物與試劑 參黃膠囊:其組成為黃連、黃芩、大黃、葛根、丹參，經(jīng)提取得1 g 浸膏相當(dāng)于生藥11 g，分為高、中、低3 個劑量組即藥粉量0.8、0.4、0.2 g/kg，組配成10%、5%、2.5%體積分?jǐn)?shù)供實驗用;鹽酸二甲雙胍配成1.3% 體積分?jǐn)?shù)供實驗用;鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma 公司);CRP、IL-6、TNF-α 試劑盒(美國RD 公司)。

2 實驗方法

2.1 2 型糖尿病大鼠模型的建立

2.1.1 實驗分組與喂養(yǎng) SD 大鼠80 只，雄性，體質(zhì)量180 ～220 g，隨機分成兩組，A 組10 只，為正常對照組，正常飼養(yǎng)4 周，喂飼基礎(chǔ)飼料，不予特殊處理。B 組70只，為糖尿病組給予高脂高糖飲食 (豬油10%，蔗糖20%、膽固醇2.5%、膽酸鹽1%、常規(guī)飼料66.5%)4 周。

2.1.2 糖尿病大鼠模型的建立 高糖高脂飼料喂養(yǎng)4 周后，將B 組大鼠禁食12 h，不禁水，自由飲水。腹腔靜脈注射STZ 30 mg/kg (STZ 溶于0.1 mmol/L 檸檬酸緩沖液中，pH 4.5)，在上述基礎(chǔ)上繼續(xù)飼養(yǎng)高脂高糖飼料。對照組注入同等體積的枸櫞酸緩沖液，72 h 后尾靜脈取血測定大鼠空腹血糖、胰島素值及餐后2 h 血糖，以空腹血糖≥7.3 mmol/L、餐后2 h 血糖≥11.1 mmol/L、胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitive index，ISI)低于正常組(P ＜0.05)為標(biāo)準(zhǔn)篩出50 只為成模大鼠，納入本實驗。對照組注射等容量的生理鹽水。

2.2 分組給藥 將50 只成模大鼠隨機分為參黃膠囊藥粉量0.8、0.4、0.2 g/kg 組，二甲雙胍0.1 g/kg 組及模型組，給藥組以7.5 ml/kg 每天灌胃給藥，共4 周，模型組及對照組給與等容量生理鹽水。

2.3 檢測

2.3.1 血糖

2.3.1.1 餐前血糖 大鼠清晨空腹，尾靜脈取血檢測血糖。

2.3.1.2 餐后兩小時血糖 清晨喂餐后2h 尾靜脈取血檢測血糖。

2.3.2 血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 的測定

2.3.2.1 大鼠血清的制備 在給藥4 周末后，各組大鼠分別于空腹?fàn)顟B(tài)下給予1% 戊巴比妥鈉腹腔麻醉 (30 mg/kg)，腹主動脈采血8 mL，在室溫下靜置約1 h，使其分層，再離心，以3 000 r/min 離心20 min，分離血清，編號，每只大鼠的血清分裝5 管，凍于- 20 ℃，保存，備用。

2.3.2.2 檢測 將上述編號的血清樣本，解凍后，室溫平衡2 h，用全自動生物化學(xué)分析儀進行檢測。

2.3.3 抗炎指標(biāo)血清CRP、TNF-α、IL-6 的測定 用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)測定，測定方法按照試劑盒說明說操作。

3 結(jié)果

3.1 2 型糖尿病大鼠模型制備 本實驗采用小劑量腹腔脈注射STZ 30 mg/kg，結(jié)合飼養(yǎng)高糖高脂飼料復(fù)制，復(fù)制2型糖尿病大鼠模型。由于大鼠的個體差異，部分大鼠第一次腹腔脈注射STZ 30 mg/kg，模型并不完全成功，需再追加STZ，還是以30 mg/kg 的劑量。模型組大鼠毛發(fā)凌亂，無光澤，精神萎靡，食量與飲水量增多，尿量增加，呈現(xiàn)出“三多一少”特征。模型組空腹血糖達到 (17.77 ±3.04)mmol/L，與對照組空腹血糖(4.22 ±0.69)mmol/L，相比，有顯著性差異(P ＜0.01)，胰島素敏感指數(shù)降低，與對照組比較差異有顯著性(P ＜0.01)，模型組體質(zhì)量下降，TG、TC 升高，與對照組比較有顯著性差異 (P ＜0.05)。

3.2 參黃膠囊對2 型糖尿病大鼠血糖的影響 由表1 可知，模型組大鼠空腹及餐后2 h 血糖與正常組相比明顯升高，差異有顯著性(P ＜0.05);參黃膠囊高、中劑量組與模型組相比，餐前及餐后血糖都降低，差異有顯著性(P ＜0.05)，參黃膠囊低劑量組與模型組比較，差異無顯著性(P ＞0.05);二甲雙胍組與模型組相比血糖明顯降低，差異有顯著性(P ＜0.05)。

表1 參黃膠囊對2 型糖尿病大鼠空腹及餐后2 h 血糖的影響(±s，n=10)

表1 參黃膠囊對2 型糖尿病大鼠空腹及餐后2 h 血糖的影響(±s，n=10)

注:與正常組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，* P ＜0.05;與二甲雙胍組比較，# P ＜0.05;與低劑量組比較，▲P ＜0.05

組別 餐前空腹血糖/(mmol·L -1)餐后2 h 血糖/(mmol·L -1)高劑量組 10.63 ±1.91△＊▲ 12.53 ±2.32△＊▲中劑量組 11.07 ±2.19△＊▲ 13.48 ±2.78△＊▲低劑量組 14.07 ±2.46△# 16.75 ±3.11△#二甲雙胍組 9.68 ±2.09△＊▲ 11.34 ±1.67△＊▲模型組 17.34 ±2.95△ 19.26 ±3.04△正常組 4.32 ±0.65* 6.78 ±1.23*

3.3 參黃膠囊對2 型糖尿病大鼠血脂的影響 由表2 得知，模型組大鼠LDL、TC、TG 與正常組相比明顯升高，HDL 偏低，差異有顯著性(P ＜0.05);參黃膠囊高、中劑量組與模型組相比，LDL、TC、TG 明顯降低，HDL 增高，差異有顯著性(P ＜0.05)，參黃膠囊低劑量組與模型組比較，差異無顯著性(P ＞0.05);二甲雙胍組與模型組相比LDL、TC、TG 明顯降低，HDL 增高，差異有顯著性(P ＜0.05)。

3.4 參黃膠囊對2 型糖尿病大鼠CRP、TNF-α、IL-6 的影響 由表3 可知，模型組大鼠CRP、TNF-α、IL-6 與正常組相比明顯升高，差異有顯著性(P ＜0.05);參黃膠囊高、中劑量組與模型組相比，CRP、TNF-α、IL-6 降低，差異有顯著性(P ＜0.05)，參黃膠囊低劑量組與模型組比較，差異無顯著性(P ＞0.05);二甲雙胍組與模型組相比CRP、TNF-α、IL-6 明顯降低，差異有顯著性(P ＜0.05)。

表2 參黃膠囊對2 型糖尿病大鼠血脂的影響(±S，n=10)

表2 參黃膠囊對2 型糖尿病大鼠血脂的影響(±S，n=10)

注:與正常組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，*P ＜0.05;與二甲雙胍組比較，#P ＜0.05;與低劑量組比較，▲P ＜0.05

組 別 HDL/(mmol·L -1) LDL/(mmol·L -1) TC/(mmol·L -1) TG/(mmol·L -1)高劑量組 1.11 ±0.22△＊▲ 0.77 ±0.40△＊▲ 1.81 ±0.57△＊▲ 0.50 ±0.08△＊▲中劑量組 0.99 ±0.53△＊▲ 0.89 ±0.40△＊▲ 1.96 ±0.60△＊▲ 0.61 ±0.19△＊▲低劑量組 0.74 ±0.17△# 1.31 ±0.61△# 3.04 ±0.87△# 0.73 ±0.23△#二甲雙胍組 1.01 ±0.21△＊▲ 0.69 ±0.23△＊▲ 1.74 ±0.51△＊▲ 0.43 ±0.12△＊▲模型組 0.85 ±0.25△ 1.51 ±0.54△ 4.06 ±1.13△ 0.89 ±0.29△正常組 1.35 ±0.40* 0.29 ±0.09* 1.28 ±0.12* 0.3 ±0.10*

表3 參黃膠囊對2 型糖尿病大鼠CRP、TNF-α、IL-6 的影響(±s，n=10)

表3 參黃膠囊對2 型糖尿病大鼠CRP、TNF-α、IL-6 的影響(±s，n=10)

注:與正常組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，*P ＜0.05;與二甲雙胍組比較，#P ＜0.05;與低劑量組比較，▲P ＜0.05

組別 CRP/(ng·mL -1) IL-6/(pg·mL -1) TNF-a/(pg·mL -1)高劑量組 137.87±13.50△＊▲ 44.64±4.07△＊▲ 73.18±10.39△＊▲中劑量組 150.37±14.59△＊▲ 48.61±4.53△＊▲ 81.69±8.08△＊▲低劑量組 174.83±25.22△# 61.11±7.60△# 100.84±12.94△#二甲雙胍組149.28±21.36△＊▲ 44.05±4.62△＊▲ 76.90±9.61△＊▲模型組 221.02±42.21△ 78.75±15.85△ 140.47±37.84△正常組 106.89±16.17* 30.37±4.81* 47.12±10.75*

4 討論

2 型糖尿病模型的制備，本實驗選擇常用的一種制備方法，高糖高脂飲食配合小劑量STZ 誘導(dǎo)2 型糖尿病大鼠。先用高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠4 周，導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞超負(fù)荷，誘導(dǎo)胰島素抵抗［3］，再小劑量注射STZ，造成胰島細(xì)胞輕度損傷，若一次小劑量不成功，可多次小劑量注射STZ，可成功誘導(dǎo)出血糖升高及脂代謝紊亂的2 型糖尿病大鼠模型。持續(xù)性高血糖可引起糖尿病慢性并發(fā)癥已達成共識，高血糖主要通過氧化應(yīng)激激活和糖基化等通路導(dǎo)致糖尿病慢性并發(fā)癥［4］。血糖升高其氧化應(yīng)激的相應(yīng)產(chǎn)物濃度增加，氧化應(yīng)激促進體內(nèi)糖基化終末產(chǎn)物和脂氧化終末產(chǎn)物的大量生成和蓄積，影響到血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)［5］，胰島細(xì)胞的分泌［6］，以及脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達和分泌等多個方面，增加了糖尿病慢性并發(fā)癥的風(fēng)險。糖尿病心血管并發(fā)癥75%為動脈粥樣硬化(AS)。AS 早期病變是由于脂紋的形成，而EC 的損傷是其主要的原因。機體的炎性反應(yīng)在引起胰島素抵抗和粥樣血栓形成及發(fā)展中起關(guān)鍵作用［7］。各種炎性因子促進胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂、高血壓、動脈粥樣樣硬化等疾病的發(fā)生。TNF-α 和IL-6 具有抑制胰島素分泌，是胰島素抵抗的觸發(fā)因子［8］，降低胰島素敏感性，誘導(dǎo)β 細(xì)胞凋亡的作用［9］。TNF-α 還可抑制脂連素啟動子的活性，減少具有胰島素曾敏作用的脂聯(lián)素的表達，導(dǎo)致脂代謝紊亂。血清CRP 的增高可致血管內(nèi)皮損傷，促進早期動脈粥樣硬化發(fā)生，還可促進糖化和終末產(chǎn)物修飾血管壁蛋白［10］，引起血管壁增厚和彈性下降，導(dǎo)致血管并發(fā)癥發(fā)生。參黃膠囊中大黃有抗動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作用［11］，以及降糖降脂的作用［12］而AS 是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的基礎(chǔ)病變，黃連［13］(主要成分為鹽酸小檗堿)通過降低血糖值、調(diào)節(jié)脂代謝、抑制血小板黏附、聚集、降低腎組織中醛糖還原酶(aldose reductase，AR)而防治2 型糖尿病并發(fā)癥，主要為糖尿病腎病;黃芩(主要成分黃芩苷、黃芩素等)［14］有抗氧自由基活性，減低兒茶酚胺的敏感性，在缺血、缺氧時，對心、腦等重要器官有保護作用，防治糖尿病慢性并發(fā)癥。丹參［15］具有降低血清TC、TG、LDL 水平的作用，能改善動脈彈性功能，預(yù)防AS 的發(fā)生。范冠杰等［16］研究報道的降糖補腎方可顯著降低糖尿病模型大鼠血清的炎性因子水平，該方中也含有黃連、葛根等藥。結(jié)合本實驗參黃膠囊中主要成分大黃、黃連、黃芩、丹參等，從降糖、降脂、抑制炎性因子等方面對2 型糖尿病大鼠的防治作用至關(guān)重要。

［1］ 韋昭華. 糖尿病并發(fā)癥的防治進展［J］. 實用心腦肺血管病雜志，2008，16(8):61-65.

［2］ 朱麒錢，尤巧莢，李成江，等. C 反應(yīng)蛋白與2 型糖尿病大血管病變危險因素的相關(guān)性研究［J］. 中華內(nèi)分泌代謝雜志，2005，21(5):320-321.

［3］ 郝 穎，柴瑞華，于世家. 改良鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型及其飼養(yǎng)方法［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(4):784-785.

［4］ 魏 瓊，孫子林，金 暉. 血糖波動和糖尿病慢性并發(fā)癥的分子機制研究進展［J］. 中華糖尿病雜志，2012，4(9):560-563.

［5］ Chen G，Chen Y，Chen H，et al. The effect of NF-κB pathway on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by intermittent high glucose［J］. Mol Cell Biochem. 2011，34(7):127-133.

［6］ Hou Z Q，Li H L，Gao L，et al. Involvement of chronic stresses in rat islet and INS cell glucotoxicity induced by intermittent high Glucose［J］. Mol Cell Endocrinol，2008，12(1):71-78.

［7］ Graham T E，Yang Q，Bluher M，et al. Retinol-binding protein 4 and insulin resistance in lean. obese. and diabetic subjects［J］. Engl Med，2006，354(24):2552-2563.

［8］ Dandona P，Aljada A，Bandyopadhyay A. Inflammation:the link between insulin resistance，obesity and diabetes［J］.Trends Immunol，2004，25(1):4-7.

［9］ 楊義生，陳家倫. 脂肪組織分泌功能研究新進展［J］. 中華糖尿病雜志，2004，12(3):205-208.

［10］ Woodman R J，Watts G F，Puddey I B，et al. Leukoeyto count and vascular function in type 2 diabetic subjects with treated hyper-tension ［J］. Atherosclerosis，2002，163 (1 ):175-181.

［11］ 田風(fēng)勝，李振彬，王元松. 大黃對糖尿病大鼠血管病變保護機制的研究［J］. 中國中藥雜志，2008，33 (6):672-675.

［12］ 宋 冰，劉學(xué)政. 大黃素對KKAy 糖尿病小鼠脂肪組織PPAR-α 及PPAR-γ 表達影響的實驗研究［J］. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，35(10):692-695.

［13］ 龔 琳，顧 立，李曉冰. 黃連素對T2DM 大鼠主動脈病變及血清脂聯(lián)素的影響［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2012，23(10):2505-2506.

［14］ 張 濤，田林紅，王春玲. 黃芩苷對糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響實用［J］. 醫(yī)學(xué)雜志，2010，26 (13):2289-2292.

［15］ Fang Z Y，Lin R，Yuan B X，et al. Tanshinone II A downregulates the CD40 expression and decreases MMP-2 activity on atherosclerosis induced by high fatty diet in rabbit［J］. J Ethnopharmacol，2008，115(2):217-222.

［16］ 范冠杰，唐成玉，孫 璐. 降糖補腎方對糖尿病大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP 表達的影響［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2011，22(11):2721-2722.