碰碰香揮發(fā)油成分分析及抑菌活性研究

孟 雪 王志英

(1．黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025;2．東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

碰碰香(Pelargonium odoratissimum)牻牛兒苗科天竺葵屬植物，原產(chǎn)地在歐洲及西南亞地區(qū)，耐熱，不耐寒，喜陽(yáng)光。因觸碰后可散發(fā)出令人舒適的香氣而享有“碰碰香”的美稱，其氣味如薄荷，又略帶蘋果風(fēng)味，具有提神醒腦，清熱解暑，驅(qū)避蚊蟲，消炎消腫和保養(yǎng)皮膚的功效［1，2］。目前，對(duì)碰碰香揮發(fā)油化學(xué)成分分析及抑菌活性的研究未見(jiàn)報(bào)道。為此，筆者對(duì)碰碰香揮發(fā)油的成分進(jìn)行了定性定量分析，并探討其抑菌活性，尋找真正抑菌成分和天然抗菌物質(zhì)，為其藥用價(jià)值的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

(1)供試植物。碰碰香購(gòu)自黑龍江省哈爾濱市花卉市場(chǎng)。

(2)供試菌種。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)、綠膿桿菌(Pseudomonas paeruginosa)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)由東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)科國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)基為L(zhǎng)B 培養(yǎng)基。

1．2 方法

(1)揮發(fā)油的提取。將新鮮碰碰香的地上部分晾干后粉碎，稱取100g 粗粉，用水蒸氣蒸餾法［3］提取其揮發(fā)油，蒸餾時(shí)間4h，餾出物用石油醚萃取得淺黃色液體，用無(wú)水硫酸鈉干燥后冰箱中保存。

(2)GC-MS 儀器與分析條件。儀器:美國(guó)Hewlett-Packard 公司生產(chǎn)的HP 6890 puls/HP5973 GC/MS 聯(lián)用儀;GC 條件:HP-5ms 石英毛細(xì)管柱(30m×0．25mm ×0．25μm)。載氣為氦氣，流速1mL·min－1，汽化室溫度280℃。程序升溫，柱初溫80℃(2min);80℃～180℃(0min)，0℃·min－1;180℃～250℃，7．5℃·min－1，柱終溫250℃(2min)。柱流量60mL·min－1，進(jìn)量樣1μL，分流比30∶1。MS 條件:離子源為EI，離子源溫度230℃。電子能量70eV，四極桿溫度150℃，掃描質(zhì)量范圍50～500amu。標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)為美國(guó)DATABASE/NIST98．L 譜庫(kù)，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)人工檢索確定其化學(xué)組成［4］。各成分的保留指數(shù)，與文獻(xiàn)［5］化合物的保留指數(shù)進(jìn)行比較，進(jìn)一步確證各化合物。采用峰面積歸一法計(jì)算各峰的百分比含量。

(3)菌懸液的制備。將供試菌種用LB 斜面培養(yǎng)基活化，接種LB 液體培養(yǎng)基，搖床37℃恒溫震蕩24h，得到供試菌液，以無(wú)菌生理鹽水制成含106～107cfu·ml－1個(gè)細(xì)菌的菌懸液。

(4)揮發(fā)油抑菌圈的測(cè)定。采用濾紙片法［6］依次吸取100μl 各供試菌液，分別加入到LB 平板培養(yǎng)基上，用無(wú)菌玻璃三角涂棒涂布均勻。用打孔器將濾紙打成直徑5mm 的圓片，高壓滅菌后放入已涂菌的平板內(nèi)，每片滴加20μl 揮發(fā)油，對(duì)照滴加20μl 無(wú)菌水。每次實(shí)驗(yàn)3 次重復(fù)，每個(gè)平板貼放4 片實(shí)驗(yàn)樣片，1 片對(duì)照樣片。平皿置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑(mm)，計(jì)算抑菌圈直徑。公式如下:

抑菌圈直徑(mm)=測(cè)量抑菌圈直徑平均值－5

(5)揮發(fā)油有效抑菌中濃度的測(cè)定。用含5%吐溫-80的無(wú)菌水將碰碰香揮發(fā)油分別稀釋為100mg·ml－1、50mg·ml－1、10mg·ml－1、5mg·ml－1、2．5 mg·ml－1和1．25 mg·ml－1，然后在各培養(yǎng)皿中分別加入1ml 稀釋后的揮發(fā)油和9ml 55℃LB 固體培養(yǎng)基混勻，依次制成含10mg·ml－1、5mg·ml－1、1mg·ml－1、0．5mg·ml－1和0．25mg·ml－1和0．125 mg·ml－1含揮發(fā)油的平板培養(yǎng)基，待平板培養(yǎng)基凝固后取10μl 含106～107cfu·ml－1個(gè)細(xì)菌的菌懸液涂布于平板培養(yǎng)基表面，每濃度重復(fù)3 次。以接菌懸液無(wú)揮發(fā)油的LB 固體培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌懸液含揮發(fā)物的LB 固體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。置于37℃恒溫培養(yǎng)24h 后觀察計(jì)數(shù)，按如下公式計(jì)算抑菌率［7］:

抑菌率(%)=(對(duì)照菌落數(shù)－處理菌落數(shù))/對(duì)照菌落數(shù)×100%計(jì)算出抑菌率

采用SPSS10．0 軟件中的概率單位回歸法［8］測(cè)定碰碰香揮發(fā)油對(duì)供試細(xì)菌的EC50，P ＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2．1 碰碰香揮發(fā)油化學(xué)組成

經(jīng)GC-MS 分析，得到總離子色譜圖(見(jiàn)圖1)。從碰碰香揮發(fā)油中分離得到的化合物中，共鑒定出20 種化合物(見(jiàn)表1)，占總揮發(fā)油的92．36%，其中單萜類化合物占總揮發(fā)油的91．29%，相對(duì)百分含量最多的兩種單萜類化合物分別是羅勒烯和α-蒎烯，其相對(duì)百分含量分別達(dá)到了53．95% 和15．48%，其次是莰烯7．42%，檜烯5．52%，β-蒎烯5．08%。

表1 碰碰香揮發(fā)油組分分析

2．2 抑菌圈直徑的測(cè)定

參照北京藥品檢驗(yàn)所指定的常規(guī)抗生素藥敏抑菌圈標(biāo)準(zhǔn)［9］，抑菌圈在1．5cm 以上為抑菌能力強(qiáng)，用“+++”表示;1～1．5cm 為抑菌能力較強(qiáng)，用“++”表示;1cm 以下為抑菌能力弱，用“+”表示;無(wú)抑菌圈出現(xiàn)為無(wú)抑菌能力，用“－－ ”表示。

表2 碰碰香揮發(fā)油的抑菌圈直徑

同濃度的碰碰香揮發(fā)油對(duì)6 種供試細(xì)菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2 所示。其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到了1．5cm 以上;其次是炭疽芽孢桿菌，其抑菌圈直徑在1～1．5cm 之間;再次是枯草芽孢桿菌、玫瑰色微球菌、綠膿桿菌，其抑菌直徑都在1cm 以下;而對(duì)腐生葡萄球菌抑菌效果不明顯。

2．3 有效抑菌中濃度的測(cè)定

由于在抑菌圈實(shí)驗(yàn)中碰碰香揮發(fā)油對(duì)腐生葡萄球菌抑菌效果不明顯，故在抑菌率實(shí)驗(yàn)中只對(duì)其余5 種細(xì)菌進(jìn)行測(cè)定。由表3 可知:揮發(fā)油在10mg·ml－1濃度時(shí)對(duì)5 種細(xì)菌的抑菌率都是100%，隨著濃度的降低，抑菌率也隨之降低，當(dāng)降低到某一濃度時(shí)揮發(fā)油就失去了抑菌能力。

表3 碰碰香揮發(fā)油對(duì)5 種細(xì)菌的抑菌率

根據(jù)表3 數(shù)據(jù)，利用SPSS 數(shù)據(jù)分析軟件中概率單位回歸功能，計(jì)算碰碰香揮發(fā)油對(duì)5 種細(xì)菌的有效抑菌中濃度(EC50)如表4 所示。枯草芽孢桿菌的EC50是1．369 mg·ml－1，玫瑰色微球菌是1．520mg·ml－1，綠膿桿菌是1．461mg·ml－1，炭疽芽孢桿菌是1．349mg·ml－1，金黃色葡萄球菌是0．127mg·ml－1。由此可見(jiàn)，碰碰香揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。

表4 碰碰香揮發(fā)油對(duì)5 種細(xì)菌的有效抑菌中濃度(mg·ml －1)

3 討論

經(jīng)分析得知，碰碰香揮發(fā)油其主要成分是單萜類化合物，相對(duì)百分含量占總揮發(fā)油的91．29%，其中以羅勒烯(53．95%)和α-蒎烯(15．48%)含量最多，其次是莰烯(7．42%)、檜烯(5．52%)和β-蒎烯(5．08%)。根據(jù)醫(yī)療上的經(jīng)驗(yàn)，這些單萜類化合物具有驅(qū)蟲、殺蟲、抗風(fēng)濕、抗腫瘤、利尿、祛痰、止瀉和鎮(zhèn)靜等作用，因此具有很高的醫(yī)藥價(jià)值［10］。

實(shí)驗(yàn)證明，碰碰香揮發(fā)油具有很強(qiáng)的抗菌、殺菌作用，對(duì)除腐生葡萄球菌以外的5 種供試細(xì)菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制效果，且揮發(fā)油濃度越大，抑菌作用越強(qiáng)。其中揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑在1．5cm 以上，EC50為0．127mg·ml－1;其次是炭疽芽孢桿菌，其抑菌圈直徑在1～1．5cm 之間;EC50為1．349mg·ml－1。因此，碰碰香揮發(fā)油在體內(nèi)抗細(xì)菌感染方面具有一定作用，有關(guān)其抗菌機(jī)理和其他生物活性有待進(jìn)一步探討。

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