耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)研究

劉 盼，王志達(dá)（1.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰 04005；.赤峰學(xué)院第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰 04000）

鮑曼不動(dòng)桿菌主要引起醫(yī)院內(nèi)感染，我國(guó)2010 年以來(lái)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床分離率已位居第一位［1］。在醫(yī)院內(nèi)，鮑曼不動(dòng)桿菌主要來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)病房、神經(jīng)內(nèi)科及呼吸內(nèi)科，而且上述科室分離的鮑曼不動(dòng)桿菌因優(yōu)勢(shì)克隆株的播散［2］，細(xì)菌耐藥性較高，常引起醫(yī)院獲得性肺炎的暴發(fā)流行。碳青霉烯類抗生素是治療鮑曼不動(dòng)桿菌最有效的藥物，但近年來(lái)世界各地報(bào)道了多起耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌引起的醫(yī)院內(nèi)感染［3-4］，給臨床治療帶來(lái)了極大困難。因此，尋找對(duì)耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌敏感的抗菌藥物組合，對(duì)防治鮑曼不動(dòng)桿菌引起的醫(yī)院獲得性肺炎具有重要意義。本研究通過(guò)體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，旨在尋找有效對(duì)抗耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌藥物組合，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

選取2010 年3 月至2014 年1 月期間，赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院（簡(jiǎn)稱“我院”）呼吸內(nèi)科不同患者的非重復(fù)痰標(biāo)本中分離出的420株鮑曼不動(dòng)桿菌，選取其中72株耐碳青霉烯菌株作為研究對(duì)象。 選取大腸埃希菌（ATCC25922）、大腸埃希菌（ATCC35218）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）作為質(zhì)控菌株。抗菌藥物組合有：頭孢哌酮/舒巴坦（CFS）+利福平（RFP）、CFS+米諾環(huán)素（MIN）、CFS+美羅培南（MER）、CFS+左氧氟沙星（LEV）、MIN+MER。

1.2 試驗(yàn)方法

采用棋盤法設(shè)計(jì)微量肉湯稀釋法進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，比較各抗菌藥物組合單用與聯(lián)合應(yīng)用的最低抑菌濃度（MIC）及各抗菌藥物組合的聯(lián)合抑菌指數(shù)（FIC），評(píng)價(jià)各抗菌藥物組合對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌效果。

1.2.1 菌懸液的制備。挑取3～5 個(gè)新鮮培養(yǎng)、分離提純并過(guò)夜的菌落，接種于MH 肉湯中，增菌培養(yǎng)6 h，菌液用3 ml HM肉湯通過(guò)比濁儀校正至0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽儆肕H 肉湯稀釋至1.5×105CFU/ml。

1.2.2 抗菌藥物儲(chǔ)備液的制備。RFP以甲醇溶解、稀釋制成濃度為640 μg/ml的儲(chǔ)備液；其余抗菌藥物用滅菌注射用水溶解、稀釋制成濃度為1 920 μg/ml的儲(chǔ)備液。

1.2.3 接種。將CFS、RFP、MIN、MER、LEV 儲(chǔ)備液用滅菌MH肉湯稀釋成以下12個(gè)濃度梯度：128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μg/ml，將配制好的不同濃度的各抗菌藥物按“1.1”項(xiàng)下方案組合，按棋盤法設(shè)計(jì)加入96 孔平板中，每種抗菌藥物加50 μl，使兩種藥物的稀釋液分別在棋盤方陣的橫列和縱列，再于每個(gè)孔中加入100 μl的1.5×105CFU/ml的菌液，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.4 結(jié)果判斷。陽(yáng)性對(duì)照孔有菌生長(zhǎng)而空白對(duì)照孔無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)；96孔平板通過(guò)襯有黑色底板的光線觀察，板孔渾濁或孔底有網(wǎng)狀或絲狀沉淀，則為有細(xì)菌生長(zhǎng)，讀取MIC。記錄單獨(dú)應(yīng)用上述組合的抗菌藥的MIC（MIC甲藥單用和MIC乙藥單用）及組合時(shí)各抗菌藥的MIC（MIC甲藥聯(lián)用和MIC乙藥聯(lián)用），計(jì)算FIC。FIC＝MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用。FIC≤0.5，則認(rèn)為兩藥聯(lián)用有協(xié)同作用；0.5＜FIC＜1，則認(rèn)為兩藥聯(lián)用有相加作用；1＜FIC≤2，則認(rèn)為兩藥聯(lián)用為無(wú)關(guān)作用；FIC≥2，則認(rèn)為兩藥聯(lián)用有拮抗作用。

1.2.5 質(zhì)量控制。待測(cè)抗菌藥物對(duì)大腸埃希菌（ATCC25922）、大腸埃希菌（ATCC35218）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）的MIC符合2010年臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組抗菌藥單用與聯(lián)用對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC比較

（1）CFS+RFP：CFS 的MIC50和MIC90較單用時(shí)明顯下降，RFP的MIC50和MIC90均下降為單藥MIC的1/4。（2）CFS+MIN：CFS的MIC50與MIC90分別為單用時(shí)的1/2和1/4，MIN的MIC50為單用時(shí)的1/4。（3）CFS+LEV：CFS的MIC50與MIC90分別為單用時(shí)的1/2 和1/4，LEV 的MIC50為單用時(shí)的1/2。（4）CFS+MER：CFS 的MIC50與MIC90均為單用時(shí)的1/4，MER 的MIC50與MIC90為單用時(shí)的1/4 和1/2。（5）MER+MIN：MER 的MIC50與MIC90均為單用時(shí)的1/2，MIN 的MIC50與MIC90為單用時(shí)的1/4和1/2。各藥物及組合的MIC結(jié)果詳見表1。

表1 各組抗菌藥物單用與聯(lián)用對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC（μg/ml，n＝72）Tab 1 MIC of drugs used alone or in combination against Acinetobacter baumannii of each group（μg/ml，n＝72）

2.2 各抗菌藥物組合的FIC

CFS 與RFP、MIN、MER 的聯(lián)合應(yīng)用，MIN 與MER 的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌效應(yīng)主要表現(xiàn)為協(xié)同和相加作用；CFS與LEV聯(lián)合應(yīng)用主要表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用，小部分表現(xiàn)為協(xié)同和相加作用，具體結(jié)果見表2。

表2 各抗菌藥物組合的FIC構(gòu)成比（%）Tab 2 FIC proportion of each antimicrobial drug combination（%）

3 討論

3.1 試驗(yàn)抗菌藥物組合遴選依據(jù)

CFS對(duì)耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌感染有一定療效［5］，有研究顯示鮑曼不動(dòng)桿菌感染用CFS 治療效果良好［6-7］；MIN 是一種廣譜的四環(huán)素類抗生素，可與核糖體3S亞基特異性地結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）的合成，終止肽鏈的延長(zhǎng)，可有效對(duì)抗鮑曼不動(dòng)桿菌的感染［8］。也有報(bào)道顯示，RFP聯(lián)合其他抗菌藥可以治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染［9］。因此，本研究采用這幾種抗菌藥物進(jìn)行組合試驗(yàn)。

3.2 鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥趨勢(shì)及誘發(fā)因素

鮑曼不動(dòng)桿菌是臨床常見條件致病菌，碳青霉烯類抗菌藥曾對(duì)該菌具有較好的抗菌作用，然而近幾年隨著碳青霉烯類藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)其耐藥率逐漸上升。據(jù)CHINET 中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)檢測(cè)結(jié)果顯示，2009 年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)MER 和亞胺培南的耐藥率分別為52.4%和50.0%，2010 年分別上升至58.3%和57.1%［1］。而我院檢驗(yàn)科細(xì)菌室對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果也提示鮑曼不動(dòng)桿菌不僅對(duì)亞胺培南、MER 耐藥，而且對(duì)廣譜青霉素如哌拉西林/他唑巴坦和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類氨曲南的耐藥率也已接近100%，對(duì)頭孢他啶、頭孢哌酮的耐藥率也達(dá)80%以上，對(duì)氨基糖苷類慶大霉素、阿米卡星的耐藥率大于90%，甚至對(duì)多粘菌素B的耐藥率也達(dá)30%以上，可見鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物呈現(xiàn)出高耐藥性。導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的因素很多，主要有患者住院時(shí)間長(zhǎng)、抗菌藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用、患者自身患有多種基礎(chǔ)疾病、醫(yī)院內(nèi)侵襲性操作、患者免疫力及營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)差等。由于對(duì)耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌引起的感染尚缺乏有效的抗菌藥物［9］，臨床已報(bào)道了多起耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌引起的院內(nèi)感染的暴發(fā)流行。

3.3 鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制及抗菌藥物單用及聯(lián)合應(yīng)用的抑菌活性

鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生碳青霉烯酶、青霉素結(jié)合蛋白改變、外排泵的表達(dá)、膜孔道蛋白的缺失等。CFS治療耐碳青霉烯的鮑曼不動(dòng)桿菌感染效果良好，因?yàn)槭姘吞箍膳c鮑曼不動(dòng)桿菌的青霉素結(jié)合蛋白不可逆地結(jié)合，同時(shí)抑制碳青霉烯水解酶的活性。但有研究表明，2009 年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)CFS的耐藥率達(dá)23.6%，顯著高于2008年的14.6%；且抗菌藥物單一使用多因劑量大、濃度高，會(huì)產(chǎn)生肝腎毒性，長(zhǎng)期單一用藥又易誘發(fā)細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生。在此情況下，聯(lián)合用藥成為必要的選擇，尤其是對(duì)重癥感染?；诖耍狙芯恳訡FS為主藥，分別聯(lián)合RFP、MIN、MER 和LEV 進(jìn)行聯(lián)合體外藥敏試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)MIN 聯(lián)合MER 進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，計(jì)算各藥單用及聯(lián)合應(yīng)用的FIC，來(lái)判斷各抗菌藥聯(lián)合應(yīng)用的抗菌效應(yīng)，以尋找最佳的對(duì)抗耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌感染的抗菌藥物組合。抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，CFS 與RFP、MER、MIN 聯(lián)合應(yīng)用后，各藥的MIC50和MIC90均較單用時(shí)顯著下降，F(xiàn)IC 主要表現(xiàn)為協(xié)同與相加作用，說(shuō)明CFS 與上述藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌具有較好的體外抑菌活性。同樣，MER 與MIN聯(lián)合應(yīng)用也對(duì)耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生了良好的體外抑菌活性。而CFS 與LEV 聯(lián)合應(yīng)用則多數(shù)表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用，對(duì)部分耐碳青霉烯酶鮑曼不動(dòng)桿菌有協(xié)同作用。

綜上所述，由耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌引起的醫(yī)院內(nèi)感染，臨床可根據(jù)患者個(gè)體情況分別選擇CFS 與RFP、MIN、MER聯(lián)用或MIN與MER聯(lián)用來(lái)進(jìn)行治療，可獲得協(xié)同及相加的抗菌效果。

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