高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定黃連清胃丸中梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量

夏伊麗 ，李 煌，朱 鳳(武警浙江省總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，浙江 嘉興 314000)

黃連清胃丸是中藥復(fù)方制劑，處方源自國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第九冊，由梔子、知母等20 味中藥組成，具有清胃瀉火的功效，用于口舌生瘡、牙齦腫痛、胃熱牙痛、暴發(fā)火眼等癥的治療［1］。梔子和知母作為方中主要成分，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對性狀進(jìn)行了控制，未對方中任何藥物進(jìn)行定量檢測，為保證藥品質(zhì)量和臨床用藥安全有效，本文采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)法對梔子中的梔子苷、知母中的知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ進(jìn)行定量研究，為完善黃連清胃丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-10ATVP 型高效液相色譜(HPLC)儀(日本島津公司生產(chǎn));Alltech 2000ES 型蒸發(fā)光散射器，ANASTAR 色譜數(shù)據(jù)工作站。

1.2 藥品與試劑

梔子苷對照品(批號:110749-201115，含量以99．7%計(jì))、知母皂苷BⅡ?qū)φ掌?批號:111839-201102，含量以93．2%計(jì))均購自中國食品藥品檢定研究院;知母皂苷AⅢ對照品(批號:41059-79-4，純度≥98．0%)購自上海純優(yōu)生物科技有限公司;黃連清胃丸(規(guī)格:每袋裝10 g;批號:130901、130905、130907)購自哈爾濱同一堂藥業(yè)有限公司;乙腈(色譜純，天津康科德科技有限公司生產(chǎn));甲醇(色譜純，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn));水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

C18色譜柱(4．6 mm×250 mm，5 μm);乙腈-水(30∶70)為流動相;柱溫為室溫;流速為0．9 ml/min;ELSD 檢測器檢測參數(shù):漂移管溫度90 ℃，載氣(N2)流速2．9 SLPM/min。理論塔板數(shù)以知母皂苷AⅢ計(jì)算應(yīng)不低于3 500［2-12］。

2.2 對照品混合溶液的制備

精密稱取梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ?qū)φ掌犯鬟m量，加50%乙醇制成梔子苷(0．061 8 mg/ml)、知母皂苷AⅢ(0．047 6 mg/ml)和知母皂苷BⅡ(0．184 2 mg/ml)的對照品混合溶液［2-12］。

2.3 供試品溶液的制備

取本品適量，精密稱定，研成細(xì)粉，精密稱取2．0 g，精密加入50%乙醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率40 KHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取濾液作為供試品溶液［2-12］。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方比例稱取除梔子的其余藥味和除知母的其余藥味各1 份，按制備工藝分別制成陰性樣品，按上述供試品制備方法分別制成缺梔子的陰性對照溶液和缺知母的陰性對照溶液［2-12］。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品混合溶液1、5、10、15、20 μl，按擬定的色譜條件測定，分別以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的量為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程［2-12］。梔子苷回歸方程:Y=1．065 7X+5．367 4，r=0．999 2，知母皂苷AⅢ回歸方程:Y=1．341 6X+4．357 1，r=0．999 7，知母皂苷BⅡ回歸方程:Y=1．268 4X+6．214 1，r=0．9993，結(jié)果表明進(jìn)樣量梔子苷在0．061 8～1．236 0 μg、知母皂苷AⅢ在0．047 6～0．952 0 μg、知母皂苷BⅡ在0．184 2～3．684 0 μg 時進(jìn)樣量積分值與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 陰性對照試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液、供試品溶液、缺梔子的陰性對照溶液及缺知母的陰性對照溶液各10 ul，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析［2-12］，結(jié)果顯示供試品溶液色譜中，在與梔子苷、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ?qū)φ掌废嗤Ａ魰r間處有吸收峰，而陰性對照溶液相同保留時間未顯吸收峰，見圖1。故認(rèn)為處方中其他藥物對該項(xiàng)含量測定無干擾。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一個供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，按上述色譜條件測定梔子苷、知母皂苷A Ⅲ和知母皂苷B Ⅱ的峰面積［2-12］，結(jié)果表明，儀器精密度良好，梔子苷的RSD為0．64%，知母皂苷AⅢ的RSD為0．72%，知母皂苷B Ⅱ的RSD為0．77%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于配制后0、1、2、4、6、8 h 精密吸取10 μl，測定其峰面積，考察樣品溶液的穩(wěn)定性［2-12］，結(jié)果表明，供試品溶液8 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，梔子苷的RSD為0．57%，知母皂苷AⅢ的RSD為0．38%，知母皂苷BⅡ的RSD為0．91%。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，按上述方法制備6 份供試品溶液，分別測定其含量［2-12］，結(jié)果表明本方法重復(fù)性較好，梔子苷的RSD為0．33%，知母皂苷AⅢ的RSD為0．85%，知母皂苷BⅡ的RSD為0．79%。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量(梔子苷含量1．56 mg/g，知母皂苷AⅢ含量1．18 mg/g，知母皂苷BⅡ含量4．62 mg/g)的同一批號樣品，研細(xì)，取1．0 g，精密稱定，分別精密加入對照品混合溶液25 ml，再精密加入50%乙醇25 ml，按上述供試品溶液制備方法制成加樣供試品溶液。精密吸取加樣供試品溶液10 μl，注入HPLC 儀，計(jì)算加樣回收率［2-12］，結(jié)果表明，本法具有良好回收率，見表1。

表1 梔子苷、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery test on Geniposide，Timosaponin AⅢand Timosaponin BⅡ

2.11 樣品含量測定

取3 批樣品按上述測定方法分別精密吸取對照品混合溶液5、10 μl 和供試品溶液10 μl，注入HPLC 儀測定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程分別測定本品中梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量，見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)Tab 2 Determination results of contents of samples (n=3)

圖1 梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的HPLC-ELSDFig 1 HPLC-ELSD of Geniposide，Timosaponin AⅢand Timosaponin BⅡ

3 討論

實(shí)驗(yàn)過程中曾對ELSD 參數(shù)進(jìn)行反復(fù)研究，最終確定乙腈-水(30∶70)為流動相，流速為0．9 ml/min，漂移管溫度為90 ℃，載氣(N2)流速為2．9 SLPM/min。此時樣品中梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ與其他組分峰可達(dá)基線分離，分離度良好，峰型對稱。

提取方式的選擇考慮到制劑生產(chǎn)時檢驗(yàn)的便捷性，采用超聲(功率300 W，頻率40 kHz)提取進(jìn)行試驗(yàn)，提取時間分別以20、30、40 min 進(jìn)行考察，結(jié)果30 和40 min 結(jié)果相差不大，而提取20 min 時含量明顯低于30 和40 min，因此超聲提取時間定為30 min。

本方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可用于測定黃連清胃丸中梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量。

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