11個攜帶線粒體tRNASer(UCN) G7444A突變的中國漢族非綜合征型耳聾家系分析評估

唐霄雯，陽婭玲，高應(yīng)龍，肖紅利，何哲耘，鄭靜，3，鄭斌嬌，呂建新，金龍金，管敏鑫，3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) Attardi線粒體生物醫(yī)學(xué)研究院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 仁濟學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.浙江大學(xué) 遺傳研究所，浙江 杭州 310058）

耳聾是人類感覺系統(tǒng)障礙最常見的疾病之一。50%以上的耳聾是由遺傳因素造成的，遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X-連鎖以及母系遺傳等[1-2]。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變是母系遺傳性耳聾重要的分子遺傳基礎(chǔ)。目前與氨基糖甙類（aminoglycoside antibiotics，AmAn）藥物性耳聾和非綜合征型耳聾密切相關(guān)的mtDNA突變主要集中在線粒體12S rRNA和tRNASer(UCN)基因上[3-5]。其中位于線粒體12S rRNA上的A1555G和C1494T突變分別導(dǎo)致新的G-C和A-U堿基配對的形成，在線粒體12S rRNA上形成一個與AmAn結(jié)合的位點，使該類藥物更容易結(jié)合到線粒體12S rRNA上，從而導(dǎo)致耳聾的發(fā)生[6-7]。而位于線粒體tRNASer(UCN)基因上的A7445G、A7445C、G7444A、7472insC、T7510C和T7511C突變在功能上已經(jīng)被證明與非綜合征型耳聾發(fā)病相關(guān)[8-13]。本研究將對已收集的以及新發(fā)現(xiàn)的11個攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變的中國漢族母系遺傳非綜合征型耳聾家系從臨床、家系和分子遺傳學(xué)等角度進行詳細的評估和分析。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選取2003年4月-2013年12月本課題組收集的中國漢族非綜合征型耳聾患者樣本2 650例。所有患者的臨床資料以及外周血樣采集均依據(jù)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會管理規(guī)定執(zhí)行。經(jīng)溫州、寧波地區(qū)4家醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門診進行詳細的發(fā)病史調(diào)查和體格檢查，確定患者是否具有其他臨床疾病表型，是否有AmAn使用史，以及是否有噪聲接觸史等其他致聾因素。

1.2 聽力學(xué)檢查 聽力學(xué)檢查主要包括純音測聽（pure tone audiometry，PTA）、聽覺腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）、聲阻抗以及畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（distortion product otoacoustic，DPOAE）。以聽力水平的分貝（dB）值為單位記錄PTA結(jié)果，并以頻率500、1 000、2 000、4 000和8 000 Hz的聽閾平均值計算，根據(jù)標準對患者聽力損失程度進行分類，分5級：正?！?5 dB，輕度聾=26～40 dB，中度聾=4l～70 dB，重度聾=71～90 dB和極重度聾＞90 dB。PTA的聽力曲線類型分為斜坡型（slope）：聽力損失主要以2 000～8 000 Hz為主，患者聽力閾值水平隨測試頻率的升高而逐漸升高；平坦型（flat）：也稱全頻聽力下降型曲線，患者各聲音頻率的聽力水平基本一致；上升型（rising）：患者的低頻聽力250～1 000 Hz較差，隨測試頻率的升高聽力閾值逐漸降低；谷型（valley）：聽力損失以500～2 000 Hz為主；切跡型（notched）：僅單一頻率處閾值明顯升高，相鄰頻率正?；蚪咏谡?；山型（ridge）：中間頻率閾值比兩端至少低20 dB。

1.3 耳聾相關(guān)熱點基因突變檢測

1.3.1 全基因組DNA提?。菏紫瘸槿《@患者外周靜脈血2～3 mL（EDTA抗凝），使用DNA提取試劑盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0）提取全基因組DNA，-20 ℃保存。嬰幼兒可采用三菱針針刺患兒耳垂、足底或手指，濾紙吸取2～3滴靜脈血后使用酚氯仿手工法提取全基因組DNA[14]，-20 ℃保存。

1.3.2 耳聾相關(guān)熱點基因突變檢測：以提取的全基因組DNA為模板，PCR擴增耳聾患者的線粒體12S rRNA、tRNASer(UCN)基因以及GJB2基因編碼區(qū)[15-16]，相應(yīng)PCR擴增信息及測序峰圖如表1和圖1所示。

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送華大基因測序公司進行雙向測序，測序結(jié)果與校正的劍橋標準序列進行比對[17]，以確定是否含有耳聾相關(guān)熱點基因突變。

2 結(jié)果

2.1 先證者臨床資料分析 新發(fā)現(xiàn)的4個攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變家系如圖2所示。NB133家系，先證者（II-3），男，24歲，2歲時因感冒靜脈注射AmAn抗感染1 d，1個月后發(fā)現(xiàn)雙側(cè)聽力下降，用藥前說話正常。先證者的兩個哥哥均表現(xiàn)為中度耳聾，大哥（II-4），42歲，有慶大霉素、新霉素用藥史，右耳聽閾55 dB，左耳聽閾53 dB；二哥（II-6），39歲，右耳聽閾52 dB，左耳聽閾62 dB，聽力曲線均為斜坡型。家系其他成員無AmAn用藥史且聽力正常。NB148家系，先證者（III-2），男，19歲，先天性耳聾，7～8個月時有用藥史（具體用藥不詳)，用藥后逐漸出現(xiàn)聽力下降。先證者弟弟（III-1），男，16歲，1個月時發(fā)現(xiàn)聽力損失，右耳聽閾113 dB，左耳聽閾110 dB，聽力曲線為斜坡型。家系其他成員聽力正常。WLT024家系，先證者（III-2），女，13歲，無明確用藥史，1歲時發(fā)現(xiàn)聽力不好，測聽發(fā)現(xiàn)極重度聽力下降。右耳聽閾110 dB，左耳聽閾115 dB，聽力曲線為平坦型。先證者表弟（III-10），男，7歲，先天性耳聾。WLT122家系，先證者（III-1），女，4歲，出生時對聲音有反應(yīng)，2歲時無誘因出現(xiàn)聽力下降，否認AmAn用藥史。右耳聽閾108 dB，左耳聽閾106 dB。先證者表弟（III-3）先天性耳聾，其母親懷孕7個月時白帶檢驗支原體陽性，醫(yī)生曾告誡孩子出生后可能為聾啞兒。其他7個家系先證者及母系成員詳細臨床資料見楊愛芬等[18]和Jin等[19]報道。

表1 線粒體12S rRNA、tRNASer(UCN) 基因以及GJB2基因編碼區(qū)擴增信息

圖1 線粒體tRNASer(UCN)基因G7444A突變測序峰圖

圖2 4個攜帶線粒體tRNASer(UCN) G7444A突變的耳聾家系圖

攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A基因突變非綜合征型耳聾家系11個先證者（見表2），男7個，女4個，測聽年齡4～24歲不等，發(fā)病年齡均在嬰幼兒時期（＜3歲）。其中3例無AmAn用藥史，11例患者均表現(xiàn)為雙耳對稱性聽力下降，聽力下降水平均為重度及以上。聽閾以高頻下降為主，PTA聽閾曲線以斜坡型居多。

表2 11個攜帶線粒體tRNASer(UCN) G7444A基因突變家系先證者臨床資料

2.2 耳聾相關(guān)突變熱點分析 線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變與非綜合征型耳聾相關(guān)[10]。該突變造成線粒體重鏈上COI基因終止密碼子AGA改變?yōu)锳AA，導(dǎo)致COI基因翻譯出的多肽在羧基末端增加了3個氨基酸殘基（Lys、Gln和Lys）。同時，線粒體tRNASer(UCN)G7444A位點臨近輕鏈上tRNASer(UCN)前體3’端核酸外切酶的作用位點（見圖3）[9，12-13，20]，而且線粒體tRNA初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端多余核苷酸需在核酸外切酶的作用下從末端逐個切除[21]，因此，線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能影響tRNASer(UCN)的加工修飾。Guan等[22-23]發(fā)現(xiàn)tRNASer(UCN)前體上A7445G突變可造成tRNASer(UCN)前體加工缺陷，從而導(dǎo)致tRNASer(UCN)穩(wěn)定性和ND6 mRNA量的明顯下降。而線粒體tRNASer(UCN)7444位點與7445位點位置相鄰，可能通過相似機制影響線粒體功能。

圖3 人類線粒體tRNASer(UCN)二級結(jié)構(gòu)圖

本研究對收集的2 650例中國漢族非綜合征型耳聾樣本進行耳聾相關(guān)突變熱點分析發(fā)現(xiàn)，其中14例攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變，突變率為0.5%。在僅攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變的LS40、RA119、HA186和HA115 4個家系中，考慮AmAn用藥史的情況下，外顯率分別為9%、37.5%、13.3%、6.7%；不考慮AmAn用藥史的情況下外顯率分別為0、25%、7.7%、0。表明線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能在AmAn性耳聾中發(fā)揮一定的作用。這11個中國漢族非綜合征型耳聾家系母系成員在聽力損失嚴重程度、發(fā)病年齡以及耳聾外顯率方面存在較大差異，推測除線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變在這些家系中發(fā)揮作用外，可能其他因素如核基因和線粒體背景等因素也發(fā)揮一定的作用。在11個攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變耳聾家系中，母系人數(shù)共126人，其中26人發(fā)病，男16人，女10人。當包括和不包括AmAn使用史時，耳聾的平均外顯率分別為20.6%和10.3%，明顯高于只攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變家系耳聾外顯率，而這6個家系同時攜帶有其他突變位點（表3所示）。如NB133家系同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A和線粒體12S rRNA C1494T突變，外顯率高達42.9%。SX003、YJ042和YJ049 3個家系同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A和線粒體12S rRNA A1555G突變，平均發(fā)病率為29.4%。線粒體12S rRNA A1555G和C1494T突變是目前已知的與母系遺傳藥物性耳聾和非綜合征型耳聾發(fā)病密切相關(guān)的主要線粒體突變位點，世界各地已有多個相關(guān)報道[6，24-25]。不僅如此這幾個家系家系內(nèi)和家系間的母系成員在聽力損失程度、發(fā)病年齡以及聽力臨床表型上都存在很大差異[17-19，26-29]。因此，推測在這6個家系中，線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能與線粒體12S rRNA A1555G和C1494T原發(fā)突變存在協(xié)同作用，共同影響非綜合征型耳聾的表型表達。除此之外，2001年，Abe等[30]報道了1個同時攜帶線粒體12S rRNA A1555G突變和GJB2基因突變的日本耳聾家系，并認為GJB2基因突變加重了mtDNA突變導(dǎo)致的耳聾表型。Kokotas等[31]也報道了一個同時攜帶GJB 235delG雜合突變和線粒體tRNASer(UCN)G7444A同質(zhì)性突變的希臘耳聾家系。目前，僅在一些中國、日本、西班牙及希臘等耳聾家系中報道了GJB2基因突變和mtDNA突變協(xié)同致病現(xiàn)象[32]。本研究中發(fā)現(xiàn)的WLT024和WLT122家系同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A和GJB2 235delC-/-突變，家系耳聾平均外顯率為19.0%。耳聾外顯率與只攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變5個家系不考慮AmAn用藥史的情況下的平均外顯率差別不明顯，是否存在協(xié)同作用仍需要對家系進行深入調(diào)查，并進行進一步的功能驗證。

表3 11個攜帶線粒體tRNASer(UCN) G7444A突變耳聾家系臨床及分子遺傳學(xué)資料

3 討論

本研究探討了11個攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A基因突變的中國漢族非綜合征型耳聾家系的臨床、家系、遺傳學(xué)特征及可能的分子致聾機制。這11個家系中，聽力障礙作為唯一的臨床表型僅存在于母系成員中（除同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和GJB2 235delC的家系外），提示在這11個家系中耳聾的發(fā)病與線粒體DNA的突變密切相關(guān)。同時針對耳聾相關(guān)的熱點突變篩查發(fā)現(xiàn)，在2 650例中國漢族非綜合征型耳聾患者中，14例攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變，突變率為0.53%，分屬于11個耳聾家系。在這11個攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變的家系中，其中同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線粒體12S rRNA A1555G、12S rRNA C1494T或GJB2 c.235delC的家系分別為3、1和2個。這6個家系中家系內(nèi)和家系間的母系成員在聽力損失程度、發(fā)病年齡以及聽力臨床表征上均存在很大差異。同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線粒體12S rRNA A1555G、C1494T或GJB2 c.235delC突變的家系的耳聾平均外顯率分別為29.4%、42.9%和19.0%，而且同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線粒體12S rRNA A1555G或C1494T突變家系耳聾的平均外顯率明顯高于只攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變耳聾家系的平均外顯率14.0%。提示在這11個中國漢族非綜合征型耳聾家系中，攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線粒體12S rRNA A1555G、C1494T或GJB2 c.235delC突變的6個家系線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能與線粒體12S rRNA A1555G和C1494T原發(fā)突變存在協(xié)同作用，共同影響這些非中國漢族非綜合征型耳聾家系耳聾的表型。然而明確線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線粒體12S rRNA A1555G或C1494T突變之間是否存在協(xié)同作用，進一步揭示母系遺傳性耳聾的分子致病機制仍需要深入開展功能驗證相關(guān)研究。

[1] Morton CC. Genetics, genomics and gene discovery in the auditory system[J]. Hum Mol Genet, 2002, 11(10): 1229-1240.

[2] Xing G, Chen Z, Cao X. Mitochondrial rRNA and tRNA and hearing function[J]. Cell Res, 2007, 17(3): 227-239.

[3] Prezant TR, Agapian JV, Bohlman MC, et al. Mitochondrial ribosomal RNA mutation associated with both antibioticinduced and non-syndromic deafness[J]. Nat Genet, 1993,4(3): 289-294.

[4] Li R, Xing G, Yan M, et al. Cosegregation of C-insertion at position 961 with the A1555G mutation of the mitochondrial 12S rRNA gene in a large Chinese family with maternally inherited hearing loss[J]. Am J Med Genet A, 2004,124A(2): 113-117.

[5] 趙立東, 王秋菊, 郭維維, 等. 與線粒體 DNA A1555G突變有關(guān)的非綜合征型耳聾[J]. 中華耳科學(xué)雜志, 2004, 2(2):136-141.

[6] Zhao H, Li R, Wang Q, et al. Maternally inherited aminoglycoside-induced and nonsyndromic deafness is associated with the novel C1494T mutation in the mitochondrial 12S rRNA gene in a large Chinese family[J]. Am J Hum Genet,2004, 74(1): 139-152.

[7] Hamasaki K, Rando RR. Specific binding of aminoglycosides to a human rRNA construct based on a DNA polymorphism which causes aminoglycoside-induced deafness[J]. Biochemistry, 1997, 36(40): 12323-12328.

[8] Pandya A, Xia XJ, Erdenetungalag R, et al. Heterogenous point mutations in the mitochondrial tRNASer(UCN)precursor coexisting with the A1555G mutation in deaf students from Mongolia[J]. Am J Hum Genet, 1999, 65(6): 1803-1806.

[9] Li R, Ishikawa K, Deng JH, et al. Maternally inherited nonsyndromic hearing loss is associated with the T7511C mutation in the mitochondrial tRNASer(UCN)gene in a Japanese family[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 328(1): 32-37.

[10] 李為民, 韓東一, 袁慧軍, 等. 非綜合征型遺傳性聾家系系譜分析及mtDNA 12S rRNA tRNALeu(UUR)tRNASer(UCN)基因突變分析[J]. 臨床耳鼻咽喉科雜志, 2004, 18(10): 582-585.

[11] Yuan H, Qian Y, Xu Y, et al. Cosegregation of the G7444A mutation in the mitochondrial COI/tRNA(Ser(UCN)) genes with the 12S rRNA A1555G mutation in a Chinese family with aminoglycoside-induced and nonsyndromic hearing loss[J]. Am J Med Genet A, 2005, 138A(2): 133-140.

[12] Yuan H, Chen J, Liu X, et al. Coexistence of mitochondrial 12S rRNA C1494T and CO1/tRNASer(UCN)G7444A mutations in two Han Chinese pedigrees with aminoglycosideinduced and non-syndromic hearing loss[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 362(1): 94-100.

[13] Fischel-Ghodsian N, Prezant TR, Fournier P, et al. Mitochondrial mutation associated with nonsyndromic deafness[J]. Am J Otolaryngol, 1995, 16(6): 403-408.

[14] 張永梅, 冀延春, 劉曉玲, 等. 線粒體tRNAGluA14693G可能是與Leber遺傳性視神經(jīng)[J]. 遺傳, 2010, 32(4): 35-3359.

[15] Ruiz-Pesini E, Wallace DC. Evidence for adaptive selection acting on the tRNA and rRNA genes of human mitochondrial DNA[J]. Hum Mutat, 2006, 27(11): 1072-1081.

[16] Lu J, Li Z, Zhu Y, et al. Mitochondrial 12S rRNA variants in 1642 Han Chinese pediatric subjects with aminoglycosideinduced and nonsyndromic hearing loss[J]. Mitochondrion,2010, 10(4): 380-390.

[17] Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PF, et al. Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA[J]. Nat Genet, 1999, 23(2): 147.

[18] 楊愛芬, 鄭靜, 呂建新, 等. 修飾因子對線粒體DNA突變致聾的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2010, 28(2): 16-5171.

[19] Jin L, Yang A, Zhu Y, et al. Mitochondrial tRNASer(UCN)gene is the hot spot for mutations associated with aminoglycoside-induced and non-syndromic hearing loss[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 361(1): 133-139.

[20] Zhu Y, Qian Y, Tang X, et al. Aminoglycoside-induced and non-syndromic hearing loss is associated with the G7444A mutation in the mitochondrial COI/tRNASer(UCN)genes in two Chinese families[J]. Biochem Biophys Res Commun,2006, 342(3): 843-850.

[21] Levinger L, Morl M, Florentz C. Mitochondrial tRNA 3’end metabolism and human disease[J]. Nucleic Acids Res,2004, 32(18): 5430-5441.

[22] Guan MX, Enriquez JA, Fischel-Ghodsian N, et al. The deafness-associated mitochondrial DNA mutation at position 7445, which affects tRNASer(UCN)precursor processing, has long-range effects on NADH dehydrogenase subunit ND6 gene expression[J]. Mol Cell Biol, 1998, 18(10):5868-5879.

[23] 鄭靜, 鄭斌嬌, 方芳, 等. 與耳聾相關(guān)的線粒體tRNA突變[J]. 生物化學(xué)與生物物理進展, 2012, 39(1): 2-230.

[24] Chen J, Yang L, Yang A, et al. Maternally inherited aminoglycoside-induced and nonsyndromic hearing loss is associated with the 12S rRNA C1494T mutation in three Han Chinese pedigrees[J]. Gene, 2007, 401(1-2): 4-11.

[25] Estivill X, Govea N, Barcelo E, et al. Familial progressive sensorineural deafness is mainly due to the mtDNA A1555G mutation and is enhanced by treatment of aminoglycosides[J]. Am J Hum Genet, 1998, 62(1): 27-35.

[26] Tang X, Yang L, Zhu Y, et al. Very low penetrance of hearing loss in seven Han Chinese pedigrees carrying the deafness-associated 12S rRNA A1555G mutation[J]. Gene,2007, 393 (1-2): 11-19.

[27] 張婷, 陳波蓓, 鄭靜, 等. 五個母系遺傳非綜合征性耳聾和藥物性耳聾的中國漢族家系[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2011, 28(4): 367-373.

[28] Chen B, Sun D, Yang L, et al. Mitochondrial ND5 T12338C,tRNACysT5802C, and tRNAThrG15927A variants may have a modifying role in the phenotypic manifestation of deafness-associated 12S rRNA A1555G mutation in three Han Chinese pedigrees[J]. Am J Med Genet A, 2008, 146A(10): 1248-1258.

[29] Lu J, Qian Y, Li Z, et al. Mitochondrial haplotypes may modulate the phenotypic manifestation of the deafnessassociated 12S rRNA 1555A>G mutation[J]. Mitochondrion, 2010, 10(1): 69-81.

[30] Abe S, Kelley PM, Kimberling WJ, et al. Connexin 26 gene(GJB2) mutation modulates the severity of hearing loss associated with the 1555A→G mitochondrial mutation[J]. Am J Med Genet, 2001, 103(4): 334-338.

[31] Kokotas H, Grigoriadou M, Yang L, et al. Homoplasmy of the G7444A mtDNA and heterozygosity of the GJB2 c.35delG mutations in a family with hearing loss[J]. Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 2011, 75(1): 89-94.

[32] Kokotas H, Grigoriadou M, Korres GS, et al. Are GJB2 mutations an aggravating factor in the phenotypic expression of mitochondrial non-syndromic deafness?[J]. J Hum Genet,2010, 55(5): 265-269.