乳佐劑免疫機制的研究進展

趙蘭華 李映波

乳劑(emulsion)是主要由水相、油相、乳化劑和助乳化劑組成的透明液體。國內(nèi)外對乳佐劑已有廣泛研究，包括物理性質(zhì)、穩(wěn)定性、佐劑效果和安全性。乳佐劑的廣闊應(yīng)用前景促使科研工作者深入研究其增強免疫的機制，以期為新產(chǎn)品開發(fā)，標準質(zhì)控及臨床應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

一、乳佐劑的研究現(xiàn)狀

目前乳佐劑主要用于流感、利什曼病、瘧疾等嚴重疫情的儲備佐劑。其中水包油型乳佐劑MF－59TM，已被30多個國家用于季節(jié)性三價滅活流感疫苗，為繼鋁佐劑之后被批準的人用佐劑之一;AS03已達到歐盟認證，批準用于人體;利什曼病疫苗LEISH－F3+GLA－SEⅠ期臨床試驗已在華盛頓和印度啟動，現(xiàn)有主要乳佐劑見表1。

表1 現(xiàn)有主要佐劑

二、乳佐劑的特征及優(yōu)勢

粒徑大小是微觀顆粒的最重要性質(zhì)和評價指標之一。依據(jù)納米概念的定義，嚴格意義上將粒徑10～100nm的乳劑稱為納米乳(nano－emulsion)，粒徑100～1000nm的稱為微乳(micro－emulsion)。顆粒的胞內(nèi)運輸方式具有顯著的粒徑依賴性，較小粒徑的顆粒在作為疫苗佐劑時更具有潛在的優(yōu)勢。最新獲歐盟藥品管理局認可的HumenzaTM流感H1N1型O/W佐劑AF03由賽諾菲巴斯德公司生產(chǎn)，粒徑小于100nm，可通過 0．2μm 的濾膜，為納米乳佐劑［5］。而有研究將一些粒徑在100～1000nm范圍內(nèi)的乳劑也稱為納米乳，如Hamouda將平均粒徑400nm的乳佐劑 W805EC 稱為納米乳［9］。Makidon 等［10］將一種平均粒徑479nm的O/W型乳佐劑稱為納米乳nano－emulsion。這樣容易混淆概念，這兩個粒徑范圍的乳劑應(yīng)該加以嚴格區(qū)分。乳佐劑一般具有以下特征。

1．均勻性好，運載并保護抗原:乳佐劑均勻性好，能有效包裹或吸附抗原?？诜臃N能提高抗原在胃腸道中的穩(wěn)定性，保護抗原免受蛋白酶降解;鼻腔免疫時能加強抗原遷移［11］。Shahiwala等發(fā)現(xiàn)一種由角鯊烯，Tween80，Span80組成的 W/O/W乳劑，口服比鼻腔免疫抗體水平更高，提示乳佐劑在不同免疫部位中的作用機制，可能與保護抗原免受降解有關(guān)。

2．增加抗原表面積及大小，改變免疫應(yīng)答的類型:目前，乳佐劑作為佐劑的最佳粒徑大小仍存爭議。普遍認為，佐劑顆粒的大小影響免疫反應(yīng)的類型。Kanchan和Panda發(fā)現(xiàn)200～600nm大小的顆粒容易通過淋巴結(jié)利用抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APCs)激發(fā)Th1型細胞免疫反應(yīng)，而2～8μm的顆粒則是由巨噬細胞的吞噬或胞飲作用運輸至淋巴結(jié)，激發(fā)體液免疫。Yu等［7］在研究SPO1微乳佐劑時發(fā)現(xiàn)150nm的顆粒佐劑效果最好，認為該種粒子既能有效吸附抗原又能激發(fā)吞噬細胞的識別，而100nm以下的顆粒不能捕獲抗原，200nm以上則不穩(wěn)定或不引發(fā)理想的免疫應(yīng)答。Oyewumi等［12］甚至提出將500nm作為一個分水嶺，因為500nm以上和小于500nm的粒子激發(fā)完全不同的免疫反應(yīng)。乳佐劑雖然大小分布相對均勻，但其粒徑仍是一個范圍，以現(xiàn)階段的研究資料，要提出一個完全精確區(qū)分佐劑效果的界值相對還很難。

3．緩釋抗原:Kim等口服免疫牛后發(fā)現(xiàn)，大于5μm的顆粒聚集于派氏集合淋巴結(jié)，緩慢遷移至淋巴輸出管，小于5μm的顆粒則釋放至淋巴器官，散布于淋巴系統(tǒng)各處，由此認為乳佐劑能延長抗原或多肽的半衰期，使抗原與淋巴系統(tǒng)有充分的接觸時間，產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答。Yu等［7］用體內(nèi)成像技術(shù)觀察SPO1包裹H1N1疫苗鼻腔免疫后追蹤疫苗的分散速度，發(fā)現(xiàn)單獨疫苗組12h疫苗已分布于小鼠全身各處淋巴結(jié)，24h后已基本被全部吸收，而SPO1包裹疫苗組則24h后才觀察到大量分布于腹股溝淋巴結(jié)，由此證明了SPO1微乳佐劑緩釋抗原的作用。然而緩釋抗原與免疫增強或持久應(yīng)答是否有關(guān)并無研究論證。最近，Yang等［13］的研究認為乳佐劑顆粒的分散性并不是抗原分散和緩釋的直接原因，且抗原的的緩釋或乳佐劑分散類型與其增強免疫原性是無關(guān)聯(lián)的。

4．穩(wěn)定性好:乳佐劑是透明液體，物理穩(wěn)定性好且易過濾，經(jīng)熱壓滅菌或離心不分層，易于制備和保存，適合大規(guī)模生產(chǎn)。Fox等［14］用不同油相制備的乳劑室溫下粒徑約為100nm，放置6個月粒徑基本不變，若放在37℃或60℃環(huán)境中粒徑隨保存時間增大，因此乳佐劑的穩(wěn)定性并非絕對，有相對穩(wěn)定的保質(zhì)條件和保質(zhì)期。

三、乳佐劑增強免疫的機制

機體免疫系統(tǒng)分為2個部分:天然免疫(natural immunity)和適應(yīng)性免疫(adaptive immunity)。天然免疫是保護人類或動物免受病原體侵害的第一道屏障。適應(yīng)性免疫主要由抗原特異性的T、B淋巴細胞及其抗體分子所組成。20世紀80年代以來，科學家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)某些礦物鹽或水包油乳劑能誘導巨噬細胞或樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)產(chǎn)生趨化因子，于注射部位募集淋巴細胞，引起單核細胞的分化及巨噬細胞的激活，增強抗原遞呈作用，表明乳佐劑能從天然免疫和適應(yīng)性免疫兩方面促進機體自我保護，主要表現(xiàn)在以下幾個方面:

1．誘導產(chǎn)生高水平的抗體:抗體是B淋巴細胞產(chǎn)生對機體最直接的保護力。B細胞受抗原刺激后，分化為漿細胞，產(chǎn)生大量特異性抗體，后者通過多種方式介導體液免疫應(yīng)答，如產(chǎn)生中和作用、調(diào)理作用、激活補體、介導ADCC作用等。Baldwin等［15］研制了一種由角鯊烯、甘油、卵磷脂，普朗尼克F68組成的O/W型納米乳佐劑SE(平均粒徑95nm)及一種類似MF59的微乳佐劑(平均粒徑125～150nm)作為IPV佐劑產(chǎn)生了理想的中和抗體水平。Leclercq等［16］設(shè)計的由Span80、IPM、1、2－丙二醇組成的納米乳佐劑(平均粒徑22．64nm)混合狂犬疫苗產(chǎn)生的比鋁佐劑高但比弗氏佐劑低的IgG抗體水平，ED50檢測時發(fā)現(xiàn)這種乳佐劑能產(chǎn)生比鋁佐劑和弗氏佐劑更強的血清保護力。有資料證明抗體水平可能與乳佐劑改變抗原表面積和免疫應(yīng)答類型有關(guān)，也可能與乳佐劑中某些成分有關(guān)。Fox等［14］發(fā)現(xiàn)鯊烯油相比其他油相更易刺激漿細胞的成熟及抗體水平的升高，因此認為此乳佐劑配方傾向于鯊烯油或甘油三辛酸酯等更利于刺激抗體產(chǎn)生的油相。此前Asa等提出鯊烯油佐劑能增強疫苗免疫陽性率，提高抗體水平。AS03中的維生素E具有免疫調(diào)節(jié)作用，因此，乳佐劑的效果不僅與其物理性質(zhì)有關(guān)，也可能與某些組分的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

2．促進DC細胞分化成熟及抗原遞呈:DC細胞是天然免疫與獲得性免疫間的一座橋梁，既能非特異識別和遞呈抗原，又能分泌大量細胞因子。MF59乳佐劑能加速細胞分化成DC細胞，成熟的DC細胞提供T細胞發(fā)育的理想環(huán)境，因為其分泌的炎性或抗炎性因子的平衡決定Th細胞的發(fā)育類型，所以在某種程度上DC細胞能決定初始T細胞的發(fā)育的數(shù)量和表型;乳佐劑 SPO1能上調(diào) MHCⅡ，共刺激分子CD80、CD86等表達，由此表明其促進 DC細胞成熟［7］。這種促進作用在破傷風、狂犬病、HBV、HAV疫苗中也表現(xiàn)出比鋁佐劑更強的佐劑效果，另外，Yang等認為乳佐劑中含有的表面活性劑如Tween及Span等能不同程度誘導細胞凋亡，且細胞凋亡水平越高的佐劑效果越好。原因在于凋亡細胞導致外源性抗原的交叉致敏，同時危險信號引發(fā)局部炎癥和DC細胞成熟。而Makidon等［10］則在這種凋亡機制研究中首次發(fā)現(xiàn)乳佐劑鼻腔免疫能引發(fā)鈣網(wǎng)蛋白相關(guān)的上皮細胞凋亡，從而在黏膜組織中引發(fā)廣泛的細胞因子和趨化因子反應(yīng)。因此，乳佐劑能在某種程度上決定淋巴細胞的發(fā)育類型，并通過鈣網(wǎng)蛋白相關(guān)信號通路引發(fā)細胞凋亡，進一步觸發(fā)細胞因子及趨化因子的分泌及交叉致敏反應(yīng)。

抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APCs)是指能攝取和在細胞內(nèi)加工處理抗原，并將抗原信息遞呈給T淋巴細胞的細胞，DC是目前發(fā)現(xiàn)的抗原遞呈功能最強的APC。乳佐劑包裹的抗原顆粒以其微粒性質(zhì)，成為巨噬細胞和 DC的首選吞噬目標［17］。Yang等［13］發(fā)現(xiàn)GLA－SE作為一種優(yōu)良的皮下免疫佐劑候選物，能加強胰島細胞中CD1a+/langerin+的遷移，刺激皮膚DC細胞功能，促進抗原遞呈。典型的乳佐劑MF59由Tween 80，Span85和角鯊烯乳劑組成，是一種O/W型乳佐劑(平均粒徑＜250nm)，通過激活肌肉組織中的單核細胞、巨噬細胞，DC細胞，誘導趨化激素，導致免疫細胞遷移到注射部位，信號放大后吞噬細胞流入，抗原被遞呈到淋巴結(jié)。最近，Seubert等［18］的研究更深入闡釋了MF59的佐劑作用是由于MyD88轉(zhuǎn)接蛋白的作用激活TLR信號通路，與Nlpr3炎性小體無關(guān)，解釋了其與鋁佐劑不同的免疫增強機制［19］。

3．介導CD4+T細胞反應(yīng)，分泌大量細胞因子:CD4+T細胞活化后主要可分化為Th1、Th2，二者之間存在相互制約或促進作用。決定Th1和Th2細胞分化取向的因素有遺傳因素、抗原的性質(zhì)、種類、劑量、免疫途徑、細胞膜表面分子等，尤為重要的是抗原遞呈水平的微環(huán)境。乳佐劑增強免疫的原因可能與增強CD4+T細胞相關(guān)反應(yīng)有關(guān)。W/O/W型乳佐劑PELC，由Span 85及鯊烯共聚物組成，肌內(nèi)注射免疫小鼠可以有效地節(jié)省流感疫苗抗原的用量，通過刺激T細胞增殖，促進 IFN－γ和 IL－4分泌。Behzad等［6］將GLA－SE與流感疫苗SVV結(jié)合能激活成年人外周血單核細胞 (PBMC)，促進TNF－α IL－6 IL－12及INF－γ分泌，抑制IL－10產(chǎn)生，表明GLASE傾向誘導Th1型免疫反應(yīng)。Daifalla等以利GLA－SE包裹什曼原蟲重組蛋白，發(fā)現(xiàn) GLA－SESODB1組比單獨SODB1及CpG寡脫氧核苷酸(Cp-GODN)佐劑組INF－γ和IL－10水平均高得多，認為GLA－SE介導了偏向Th1型的免疫反應(yīng)。Chiang等［8］以登革熱病毒D1EDⅢ結(jié)構(gòu)為抗原，IFN－γ和IL－4分泌水平約為鋁佐劑組的3倍，單獨疫苗組的20倍左右。多數(shù)乳佐劑傾向于Th1型免疫反應(yīng)，并不能完全證明乳佐劑佐劑激發(fā)的就是Th1型細胞免疫。在對Montinade ISA720及ISA206的研究中發(fā)現(xiàn)，此二者在不同遺傳背景的小鼠趨向不同的反應(yīng)類型，因此乳佐劑引發(fā)的免疫反應(yīng)類型與其粒徑大小及實驗動物遺傳背景有關(guān)。

4．增強 CD8+CTL反應(yīng):細胞毒作用(cytotoxic effect，CTL)是針對病毒性感染的防御方式，疫苗進入機體后，激活機體能否產(chǎn)生顯著的CD8+T細胞反應(yīng)，是體現(xiàn)疫苗臨床保護性的一個重要方面。鋁佐劑的一個重要缺陷就是不能激活細胞免疫及CTL反應(yīng)，而乳佐劑能增強這種反應(yīng)。成年人流感疫苗效果降低的一個重要原因是裂解病毒無法有效激活CTL反應(yīng)，而弗氏佐劑及Montinade ISA720乳佐劑則均被證明能誘導CTL作用。Behzad等［6］發(fā)現(xiàn)乳佐劑GLASE包裹流感疫苗增加骨髓樹突狀細胞的比例，刺激顆粒酶B分泌，表明該乳佐劑疫苗增強CD8+CTL反應(yīng)。另一方面，由于DC細胞能影響T細胞發(fā)育，乳佐劑刺激DC細胞的成熟相應(yīng)也能增強CD8+的CTL效應(yīng)。

四、問題與展望

乳劑作為載藥系統(tǒng)已引起廣泛關(guān)注并有所應(yīng)用，但作為疫苗佐劑仍需深入研究。世界范圍內(nèi)的傳染性疾病暴發(fā)從未停止，亟待疫苗及佐劑研究的突破。目前，乳佐劑的研究已逐漸深入，并取得了大量基礎(chǔ)資料。其增強免疫主要是基于納米顆粒的性質(zhì)和激發(fā)機體免疫應(yīng)答。乳佐劑的均勻穩(wěn)定性及合適的顆粒大小能保護并緩釋抗原，并因顆粒大小的不同引發(fā)不同型的免疫反應(yīng)，但是緩釋抗原與免疫增強的具體關(guān)聯(lián)并無確切闡述。免疫系統(tǒng)的應(yīng)答則是由于乳佐劑包裹疫苗刺激淋巴細胞分化發(fā)育，加快抗原遞呈的效率，引發(fā)抗體、細胞因子的分泌及ADCC、CTL作用等，這些機制的闡述為其臨床應(yīng)用提供了依據(jù)，但是人體免疫系統(tǒng)應(yīng)答復雜，乳佐劑在分子水平上系統(tǒng)全面的研究資料甚少。

另外，乳佐劑用于人體還存在許多問題，首先大多數(shù)乳佐劑配方實驗研究只在動物體內(nèi)試驗，極少進入臨床試驗，即使是MF59也因為使用的角鯊烯具有抗原性而引起注射部位腫脹壞死等現(xiàn)象，長期使用可能造成肝損傷。其次，目前應(yīng)用或研究較深入的幾種乳佐劑均加入了免疫增強劑、TLR興奮劑、或者促進免疫的中藥成分，使乳佐劑的成分復雜，不易控制質(zhì)量，使其離應(yīng)用還有一定距離［20］。加之各個實驗室對乳佐劑配方闡述模糊，因此重復性不能得到保證。弊端存在的同時是機遇，怎樣克服這些研究壁壘成為科學家們亟待解決的難題。

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