乳腺癌相關基因異常甲基化研究進展及其臨床應用

吳 亮 王建明

乳腺癌是世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤之一，目前關于乳腺癌生物標志物的研究很多，如ER、PR、HER－2等已廣泛應用于治療方案篩選，但用于特異性診斷的生物標志物還很匱乏。盡管國內外研究者正積極探索新的蛋白類生物標志物，但難以突破發(fā)展和應用中的瓶頸，即特異性抗體制備和定量檢測困難。因此，尋找新型的特異性生物標志物是實現包括乳腺癌在內的多種腫瘤早期診斷的當務之急。

隨著分子生物學領域研究的深入，人們發(fā)現DNA序列以外的調控異常在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中更為普遍，這種不依賴于DNA序列變化的可遺傳的調控稱為表觀遺傳改變，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、基因印跡以及microRNA調控等［1］。與遺傳因素不同的是，表觀遺傳受環(huán)境因素控制，其改變是可逆的。作為一種潛在分子生物標志物和藥物靶點，表觀遺傳學在腫瘤防治領域日益受到重視，其主要形式之一即DNA甲基化。

DNA甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［2］。DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉移酶(DNMT)的催化下，以S－腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉移到特定堿基上的過程。DNA甲基化可以發(fā)生在胞嘧啶的C－5位、腺嘌呤的N－6位、胞嘧啶的N－4位或鳥嘌呤的N－7位等。在哺乳動物中DNA甲基化主要發(fā)生在富含CpG島的基因啟動子區(qū)［3］。該區(qū)的CpG島發(fā)生甲基化后可導致基因轉錄受抑，蛋白表達減少，相應的生物學功能下降甚至喪失。腫瘤發(fā)生時，一般呈現全基因組低甲基化而特異基因超甲基化的現象。現已確認的超甲基化基因大多是抑癌基因，如乳腺癌中常見的超甲基化基因包括細胞周期調節(jié)、細胞凋亡、DNA修復、激素調節(jié)、細胞黏附和侵襲、血管生成等基因。

一、乳腺癌特異性位點DNA異常甲基化

近年來研究發(fā)現，多種基因在乳腺癌組織發(fā)生了異常甲基化。

1．BRCA1基因:1990年Hall等研究發(fā)現，染色體17q21與早期發(fā)生的家族性乳腺癌有關，1994年Miki等成功克隆了第1個與家族性乳腺癌和卵巢癌相關的基因，命名為BRCA1。BRCA1基因的可遺傳性突變是約50%遺傳性乳腺癌的主要分子機制，但在散發(fā)性乳腺癌中BRCA1基因的突變頻率并不高。目前已證實DNA甲基化所致的BRCA1基因失活是乳腺癌發(fā)生中的一個重要事件，而且與患者預后有關［4，5］。

2．Cyclin D2基因:Cyclin D2是D型細胞周期素的成員之一，在細胞周期中通過調控細胞周期素依賴蛋白激酶Cdk4和Cdk6的活性參與G1期到S期的過渡。Evron等(2001年)觀察到近半數的原發(fā)性乳腺癌病例組織中檢測到該基因啟動子區(qū)呈高甲基化，且與Cyclin D2 mRNA和蛋白表達缺失。

3．SFRP1基因:分泌型卷曲相關蛋白1(SFRP1)基因是Wnt信號通路的抑制劑，通過干擾配體－受體間的相互作用而阻斷Wnt信號通路。Jeong等［6］利用焦磷酸測序技術分析60例乳腺癌組織，發(fā)現基底細胞樣亞型乳腺癌SFRP1甲基化水平顯著降低，提示該基因異常甲基化可作為表觀遺傳標志物和乳腺癌預后因子。

4．CDH1基因:又稱E－鈣黏蛋白基因，編碼的E－鈣黏蛋白(E－cadherin)是一種跨膜糖蛋白，屬于細胞黏附分子家族，介導相鄰的上皮細胞間依賴鈣的細胞連接，對于維持細胞分化、極性和正常組織結構起重要作用。Caldeira等［7］應用MSP技術發(fā)現浸潤性乳腺癌患者CDH1基因高甲基化與雌激素受體ER低表達有關。Sebova等［8］發(fā)現CDH1基因甲基化水平的差異在不同淋巴結狀態(tài)亞組和不同免疫組化亞組中均有統(tǒng)計學意義，提示高甲基化的CDH1基因可以為識別潛在轉移性腫瘤提供依據。

5．APC基因:結腸癌瘤性息肉病基因(APC)由Herrera于1986年在1例格德納綜合征患者中發(fā)現。正常情況下具有多種功能，如抑制細胞生長及促進細胞凋亡、調節(jié)細胞遷移和Wnt信號轉導等。Swift－Scanlan等［9］發(fā)現APC甲基化頻率隨乳腺癌分期和腫瘤大小增長而增加，與不良預后結局有關，同時也發(fā)現APC甲基化與ER+、HER－2+乳腺癌有關，有望作為區(qū)分ER陽性與否以及癌細胞侵襲性強弱的標志。

6．RASSF1A基因:Dammann等(2000年)用酵母雙雜交篩選方法從染色體3p21．3克隆出與RAS效應蛋白Maxp1、Nore1高度同源的基因RASSF1，命名為RAS相關結構域家族1基因，其中RASSF1A是主要的轉錄本之一。Xu等［10］通過焦磷酸測序法發(fā)現RASSF1A啟動子甲基化與腫瘤復發(fā)和總生存期有關。Jiang等［11］發(fā)現RASSF1A基因啟動子高甲基化使乳腺癌患者癌癥復發(fā)及預后不良的風險增高，提示RASSF1A啟動子甲基化可能是乳腺癌的潛在預后指標。

二、乳腺癌全基因組異常甲基化

隨著研究的深入，科學家們致力于發(fā)現全基因組范圍內未知的甲基化位點。與特異性位點甲基化檢測相比，全基因組甲基化分析可以幫助我們廣泛、深入地尋找異常甲基化位點并探索其臨床應用價值。在單個基因甲基化沒有或者只有較弱的臨床預后意義的情況下，多基因甲基化標志物的聯(lián)合應用則可有效預測患者治療后的生存期長短。

Toyota等(1999年)在大腸癌的研究中發(fā)現，一些病例同時存在多個基因的異常甲基化，稱為 CpG島甲基化表型(CIMP)。CIMP涉及多個基因啟動子同時甲基化，具有腫瘤特異性，與多種腫瘤的發(fā)生或預后相關。Fang等［12］通過DNA微陣列雜交技術在乳腺癌研究中發(fā)現CIMP+腫瘤發(fā)生轉移的可能性低于CIMP－腫瘤，并且有較好的臨床結局。

Holm 等［13］使用 Illumina Golden Gate Methylation Cancer Panel檢測了807個基因的CpG位點，發(fā)現甲基化狀態(tài)與腺腔A型、腺腔B型、基底細胞樣型乳腺癌有關聯(lián)，其中腺腔B型乳腺癌的甲基化程度最高，而基底細胞樣型最低，提示不同乳腺癌分子亞型與乳腺組織中特異DNA甲基化存在關聯(lián)。

全基因組甲基化研究還發(fā)現譜系特異性甲基化現象。Sproul等［14］使用27k Infinium arrays研究了19個乳腺癌細胞系和49例原發(fā)性乳腺癌患者的14000多個基因，他提出乳腺癌DNA甲基化是細胞譜系而不是腫瘤進展的標志，同時也強調識別腫瘤特異性甲基化對未來乳腺癌的診斷和治療至關重要。

三、外周血游離DNA甲基化檢測

大多數DNA甲基化檢測需要組織標本，在臨床應用上具有一定困難。作為早期診斷或預后的潛在標志物，需要一種簡單、可靠、非侵襲性的檢測手段。20世紀40年代后期，Mandel和Metais首先在體循環(huán)中發(fā)現游離核酸。懷孕、外傷和器官移植后的健康人和癌癥患者體循環(huán)中游離DNA量較大，其分子大小在500bp～30kb之間。早在1977年Leon等就發(fā)現腫瘤患者血液循環(huán)中游離DNA的水平顯著高于正常人，且可檢測到腫瘤特異性DNA改變。之后在肺癌患者的痰液、膀胱癌和前列腺癌患者的尿液、眾多類型癌癥患者的血漿/血清中均發(fā)現DNA異常甲基化。循環(huán)DNA的遺傳及表觀遺傳學改變模式與同一個體癌灶組織細胞的DNA基本一致，且血清比血漿含量更多［15，16］。游離DNA簡便、微創(chuàng)的取材方式及其與疾病的高度相關性使其具有廣泛的臨床應用價值。人外周血循環(huán)DNA量和質的改變與疾病發(fā)生發(fā)展關系密切，有希望成為疾病診斷、療效評估及預后預測的一種重要分子標志物。但由于游離DNA的含量較低，提取比較困難，游離DNA的檢測方法不一，各自敏感度差異較大，特異性低，易發(fā)生假陰性，檢測方法還需進一步改進。

越來越多的研究證實腫瘤患者血清中有高水平的腫瘤特異性DNA改變，其中90%以上為來源于腫瘤組織的游離循環(huán)DNA，但血清中DNA含量很少，需要非常靈敏的檢驗方法［17～19］。Radpour等利用SEQUENOM's Epi TYPER技術分析了10個候選基因(APC、BIN1、BMP6、BRCA1、CST6、ESR － b、GSTP1、P16、P21、TIMP3)甲基化譜，結果發(fā)現，患者外周血循環(huán)DNA的甲基化模式與乳腺癌組織的甲基化模式高度一致，采用其中8個基因構建的DNA甲基化文庫已足以區(qū)分正常乳腺組織與乳腺癌組織，敏感度和特異性均達90%以上［16］。其他實驗方法，如基于限制性內切酶的方法(RLGS、Ms－AC－PCR等)、基于免疫的方法(MeDIP)、基于亞硫酸氫鹽轉化的方法(MSP、MS－HRM、Methylight)等已被用于游離 DNA甲基化檢測。

四、針對DNA異常甲基化的臨床治療應用

過去幾十年間，乳腺癌分子生物療法有了迅速發(fā)展，對于雌激素受體陽性患者可采用選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERMs)如他莫昔芬，芳香酶抑制劑(AIs)如阿那曲唑，選擇性雌激素受體下調劑(SERDs)如氟維司群。針對雌激素受體陰性乳腺癌患者則可先恢復其ESR1(雌激素受體α)基因表達，重建雌激素對腫瘤細胞生長的調控，再使用抗雌激素藥物治療［20］。

越來越多證據表明內分泌療法相關的雌激素受體通路與表觀遺傳機制有關［21］。與基因突變不同，表觀遺傳修飾是可逆的，因此該領域的研究有望拓展乳腺癌治療方法。對乳腺癌細胞系研究發(fā)現，DNA甲基轉移酶抑制劑可恢復ESR1的表達［22］。也有研究發(fā)現組蛋白去乙?；敢种苿┮部梢栽倩罨萍に厥荏w陰性細胞系的受體表達［21］。Michaud等在1994年研究小鼠Avy等位基因時發(fā)現，營養(yǎng)成分可以調節(jié)哺乳動物細胞表觀遺傳狀態(tài)，利用植物以及一些植物的天然產物來預防及治療各種癌癥引起了人們極大的興趣［23］。

目前可用于治療乳腺癌的甲基化轉移酶抑制劑如阿扎胞苷、地西他濱等尚存在諸多不足，它們大部分具有高毒性且缺乏基因特異性，非特異性的脫甲基還具有引起抑癌基因沉默的風險。食物的生物活性成分制劑也有缺點，例如從綠茶中提取的生物活性物質——表沒食子兒茶素沒食子酸酯(簡稱EGCG)在生理條件下非常不穩(wěn)定，姜黃中的姜黃素幾乎不溶于水，很難被胃腸道吸收［4］。盡管存在這些問題，利用天然膳食中的生物活性成分來預防和治療腫瘤仍具有廣闊的應用前景。

DNA甲基化作為一個新興研究領域，在臨床應用方面的價值日益受到重視，但缺乏簡便、靈敏、特異的檢測方法，仍是制約其廣泛應用的瓶頸［24］。DNA甲基化僅是表觀遺傳學改變的一部分，我們期待能更深入地了解乳腺癌表觀遺傳學改變，如組蛋白修飾、MicroRNA等?，F階段乳腺癌表觀遺傳學研究雖然未能完全解釋乳腺癌的發(fā)生機制，但隨著研究深入和分子生物學技術的發(fā)展，必將涌現出更多、更完善的檢測和分析方法，為表觀遺傳學研究提供強有力的技術支持。

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