骨髓增生異常綜合征(MDS)基因診斷研究

馮寶章 郝建萍 雷健玲 邵宗鴻

眾所周知，骨髓增生異常綜合征(MDS)又稱白血病前期，有5個(gè)亞型。其中難治性貧血(RA)是它們的基本型，可以轉(zhuǎn)化為原始細(xì)胞增多的 RA(RAEB)和轉(zhuǎn)化中的RAEB(RAEBT)，以及急性白血病(AL)。MDS診斷的難點(diǎn)在于RA以及同其他已知貧血出血病的鑒別診斷。筆者曾以V－erbB和V－erbB+A為探針Southern印跡雜交法對(duì)MDS進(jìn)行基因診斷研究，并獲得滿意的結(jié)果［1］。在此基礎(chǔ)上，筆者設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)引物，以MDS、再生障礙性貧血(AA)和原發(fā)性血小板減少性紫瘢(ITP)等患者骨髓細(xì)胞DNA為模板進(jìn)行PCR基因診斷研究，發(fā)現(xiàn)其中一對(duì)引物適用于約90%的MDS－RA和可疑RA的基因診斷以及同其他已知貧血出血病的鑒別診斷。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

1．病例:MDS－RA 19例，可疑 RA 13例，RAEB(T)13例;AA 17例，可疑AA 4例;ITP 15例;溶血性貧血(HA)2例;紅血病，PNH，α－地中海貧血和巨幼細(xì)胞性貧血(MA)各1例;AL和惡性腫瘤8例;慢粒和真性紅細(xì)胞增多癥(PV)3例，共98例。正常人8人。32例MDS中男性24例，女性8例?；颊吣挲g16～69歲，平均年齡44歲?？梢蒖A指RA/AA，RA/HA或RA/ITP。而可疑AA指AA/RA。細(xì)胞遺傳學(xué)研究支持可疑RA為早RA，而可疑AA為早AA［2］。此類病例隨訪結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。上述病例均由筆者醫(yī)院血液內(nèi)科診斷，其中大多數(shù)為住院患者。

2．方法:(1)PCR方法:①骨髓細(xì)胞模板DNA的提取:用小刀將患者骨髓涂片上的細(xì)胞刮下來(lái)，收集于1．5ml EP管內(nèi)，加入 TEN(15mmol/L Tris，15mmol/L EDTA，15mmol/L Nacl，pH8．0)液 500μl，10%SDS 75μl，蛋白酶 K(2．0mg/ml)10μl，于55℃水浴中孵育5h，其余步驟與文獻(xiàn)［1］相同;②聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)條件:模板變性條件為97℃ 7min，32個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中變性條件為 94℃ 5min，退火條件為52℃1min，延伸條件為72℃ 2min，最后一次循環(huán)之后延伸時(shí)間為5min，取出置于4℃保存;③PCR產(chǎn)物的檢測(cè):1．8%瓊脂糖凝膠電泳，每孔點(diǎn)樣品(PCR 產(chǎn)物)10μl，60V，30mA，電泳 20～25min，EB染色，紫外線燈下觀察結(jié)果。(2)原位雜交(ISH)方法(采用寶靈曼公司DIG－標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒):①骨髓穿刺標(biāo)本4ml于肝素管中抗凝，經(jīng)淋巴細(xì)胞懸液離心收集于EP管中，－20℃保全，以備提取DNA用;②V－erbB Oligo探針標(biāo)記:雜交前細(xì)胞涂片的予處理，予雜交和雜交，雜交后的洗滌和檢測(cè)等均按試劑盒的要求進(jìn)行;③結(jié)果觀察:顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞。細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色斑點(diǎn)為陽(yáng)性反應(yīng)。若陽(yáng)性反應(yīng)小于細(xì)胞核面積的1/4時(shí)計(jì)為“+”;陽(yáng)性反應(yīng)大于核細(xì)胞面積的1/4而小于或等于細(xì)胞核面積的2/4時(shí)計(jì)為“++”;小于或等于細(xì)胞核面積的3/4時(shí)，計(jì)為“+++”;陽(yáng)性反應(yīng)大于細(xì)胞核面積的3/4時(shí)，計(jì)為“++++”。對(duì)上述病例作V－erbB PCR和ISH檢測(cè)的同時(shí)，每例均作骨髓細(xì)胞遺傳學(xué)(包括核型分析和SCD檢測(cè))檢查，其方法見參考文獻(xiàn)［2］。

結(jié) 果

1．PCR檢測(cè)結(jié)果:對(duì)32例 MDS和12例可疑MDS作PCR檢測(cè)結(jié)果如下:①RA和可疑RA有其特殊的PCR產(chǎn)物電泳帶型即4條大小不同的條紋(圖1);②典型AA和ITP均無(wú)帶紋;③可疑AA有1～2條帶，與早期紅血病相似;④少數(shù)ITP和HA有1～2條帶紋;⑤正常人和MA無(wú)帶。其他貧血病和出血病均無(wú)此帶型。表明其高度的特異性，詳見表1。

圖1 患者骨髓V－erbB PCR檢測(cè)結(jié)果

表1 44例MDS和可疑MDS患者骨髓檢查結(jié)果

2．原位雜交檢查結(jié)果:對(duì)37例MDS(包括轉(zhuǎn)白血病者)，3例可疑MDS和19例對(duì)照組(包括8例ITP，7例AA，3例IDA和1例α－地中海貧血)原位雜交檢測(cè)結(jié)果如下:全部 MDS和2例(2/3)可疑MDS呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖2)，對(duì)照組僅1例AA有陽(yáng)性反應(yīng)。對(duì)其中22例MDS和3例可疑MDS同時(shí)進(jìn)行PCR和原位雜交檢測(cè)，結(jié)果17例MDS，2例可疑MDS為兩項(xiàng)指標(biāo)均陽(yáng)性的病例，陽(yáng)性率76%，表明兩者高度的一致性。

圖2 患者骨髓細(xì)胞V－erbB Oligos原位雜交(ISH)照片

3．動(dòng)態(tài)觀察:對(duì)上述7例MDS先后進(jìn)行兩次以上隨訪檢測(cè)并做動(dòng)態(tài)觀察，同時(shí)對(duì)MDS各期的原位雜交積分值作t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雜交信號(hào)積分值依次為:RA組 ＜RAEB(T)組 ＜轉(zhuǎn)白血病組(P＜0．001和0.005)。SCD陽(yáng)性組＜SCD陰性組(P＜0．001)，而核型正常組與異常組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明隨著MDS轉(zhuǎn)為白血病，其原位雜交積分值呈顯著性增加。這一點(diǎn)亦同原位雜交積分值與MDS患者骨髓原始和早幼粒細(xì)胞百分率的增加(P＜0．001)，和骨髓細(xì)胞SCD轉(zhuǎn)陰的結(jié)果相一致。表明原位雜交結(jié)果不僅有診斷意義還有白血病發(fā)病學(xué)意義。

討 論

如上所述，應(yīng)用現(xiàn)有這對(duì)引物PCR，約75%MDS呈陽(yáng)性反應(yīng)?？鄢?8病例，其陽(yáng)性率高達(dá)87.5% ～91．6%。說(shuō)明這對(duì)引物適用于大多數(shù)MDS基因診斷。盡管MDS與早期紅血病和良性代償性增生骨髓有相同PCR產(chǎn)物電泳帶紋(1～2條帶)，但后兩者均未見MDS－RA帶型(4條帶)，其臨床意義十分明顯。至于+8 MDS PCR陰性的原因值得研究。國(guó)際上曾有2名作者應(yīng)用V－erbB探針作Southern印跡雜交，先后對(duì)3例t(1;7)MDS進(jìn)行分析，其中1人曾獲得陽(yáng)性結(jié)果(僅見C－erbB擴(kuò)增，不見重排);另1人未能取得陽(yáng)性結(jié)果，因而無(wú)從建立PCR基因診斷法［3］。

本文1例可疑RA骨髓細(xì)胞核型46XX，病理檢查支持RA診斷。其V－erbB PCR結(jié)果顯示RA帶型(圖1)從而確認(rèn)其RA診斷。患者經(jīng)兩年余服用康力龍等雄性激素后骨髓象血象恢復(fù)正常至今已5年。在同一批PCR實(shí)驗(yàn)中，對(duì)其治療前后骨髓細(xì)胞DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果治療后其RA帶型消失。這一結(jié)果為其病情恢復(fù)正常提供了有力證據(jù)。筆者曾發(fā)現(xiàn)1例RA經(jīng)相同的治療后恢復(fù)正常。其原有的C－erbB重排/擴(kuò)增消失。說(shuō)明RA和早RA激素逆轉(zhuǎn)正常是完全可能的［4］。而筆者所建立的V－erbB PCR基因診斷法則為此提供了簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)手段。

針對(duì)上述兩條有診斷和發(fā)病學(xué)意義的Oligos，筆者設(shè)計(jì)并合成兩條反基因Oligos，經(jīng)磷酸硫代修飾后，尾靜脈注射對(duì)16只大鼠 MDS(其中15只為RAEB)進(jìn)行基因治療研究。注射后2～3個(gè)月內(nèi)15只病鼠骨髓象恢復(fù)正常，血象亦基本正常［5，6］。這一結(jié)果有力地說(shuō)明，上述正義Oligos經(jīng)地高辛標(biāo)記作骨髓細(xì)胞原位雜交結(jié)果確有診斷和發(fā)病學(xué)意義。

1 馮寶章，雷健玲，王海青，等．骨髓增生異常綜合征(MDS)基因診斷和發(fā)病原理研究［J］．中華腫瘤雜志，1995，17(增刊):159

2 馮寶章，雷健玲，劉煥勛，等．骨髓增生異常綜合征(MDS)和再生障礙性貧血(AA)等細(xì)胞遺傳學(xué)研究［J］．中華內(nèi)科雜志，1994，33:754

3 Woloschak GE，Dewald GW，Bahn RS，et al．Amplification of RNA and DNA specific erbB in unbalanced 1;7 chromosomal translocation associated with myelodysplastic syndrome［J］．Journal of Cellular Biochemstry，1986，32:23 －34

4 馮寶章，雷健玲，楊崇禮，等．白血病前期基因診斷并激素逆轉(zhuǎn)成功1例［J］．中華內(nèi)科雜志，1992，31(9):539 －542

5 馮寶章，雷健玲，林澤嬉，等．大鼠骨髓增生異常綜合征(MDS)基因治療研究［J］．中國(guó)癌癥研究進(jìn)展，1998，99:171－175

6 馮寶章，雷健玲，林澤嬉，等．大鼠骨髓增生異常綜合征基因治療及其機(jī)制研究［J］．醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39(3):129 －131