卵巢惡性腫瘤組織中微小RNA 的檢測(cè)及其臨床意義

楊群芳 嚴(yán)偉玲

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，死亡率高居女性惡性腫瘤第四位，并有逐年上升的趨勢(shì)。因此提高卵巢癌患者早期診斷以及改善其預(yù)后水平非常重要［1］。微小RNA(micro -RNA，miRNA)是一類高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，其通過(guò)調(diào)節(jié)信使RNA 表達(dá)活性在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和增殖等多個(gè)生命過(guò)程［2-3］。有研究表明miR -10a、miR-93 和miR -200a 通過(guò)影響其靶基因的表達(dá)，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后［4-6］。miR -10a、miR -93 和miR-200a 在腫瘤組織中存在異常表達(dá)的情況，同時(shí)有研究證實(shí)miR-10a 的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［7］。本研究探討miR-10a、miR-93 和miR-200a 在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)及其與卵巢癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，確認(rèn)其能否作為判斷卵巢癌預(yù)后的標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇某醫(yī)院婦產(chǎn)科2007 年6 月～2012 年12 月行卵巢手術(shù)治療的患者，患者切除的卵巢組織均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的病理學(xué)檢查確診。其中正常卵巢組織40 例，年齡26 ～58 歲，平均42.8 歲，均為子宮肌瘤病人行卵巢切除術(shù)，病理檢查無(wú)異常。卵巢良性腫瘤40 例，年齡21 ～63 歲，平均43.5 歲，包括卵巢黏液性瘤14 例，卵巢漿液性瘤22 例，畸胎瘤6 例。卵巢惡性腫瘤40 例，均為有完整隨訪資料的原發(fā)性卵巢癌患者，年齡35 ～72 歲，平均44.3 歲;按照世界衛(wèi)生組織(WHO，1973)卵巢癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，30 例為上皮細(xì)胞腫瘤，6 例為生殖細(xì)胞腫瘤，4 例性索間質(zhì)腫瘤;按照國(guó)際婦產(chǎn)聯(lián)盟(FIGO2009)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期4 例，Ⅱ期20 例，Ⅲ期11 例，Ⅳ期5 例;低分化癌21 例，高分化癌19 例;所有卵巢癌患者均行卵巢切除術(shù)和腫瘤減滅術(shù)，同時(shí)30 例上皮細(xì)胞腫瘤術(shù)后接受順鉑+紫杉醇，10 例其他性腫瘤術(shù)后行順鉑+博來(lái)霉素+長(zhǎng)春新堿聯(lián)合化療。治療后每3 個(gè)月通過(guò)電話對(duì)卵巢癌患者或其家屬進(jìn)行隨訪，隨訪至2013年6 月，中位隨訪時(shí)間為38 個(gè)月(6 ～60 個(gè)月)。

1.2 卵巢組織中提取RNA

將卵巢組織標(biāo)本從液氮中取出后放于冰上完全解凍，然后用預(yù)冷的PBS 液洗滌標(biāo)本2 次，再放于研缽中加入1 ml Trizol 液充分研磨，研磨充分后加入0.2 ml 氯仿，充分混合后取上層水相再加入0.5 ml 異丙醇，12 000 g 離心10 min，棄去上清液于加入0.75 ml 乙醇渦旋混勻后，4 ℃下7 500 g 離心5 min，再次棄去上清液于室溫干燥5 min，最后用DEPC 水溶解。檢測(cè)RNA 溶液D260/D280 吸光值，吸光值介于1.8 ～2.1 時(shí)提取的RNA 溶液才可用于cDNA 合成。將合格的RNA 溶液于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 cDNA 合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將合格的RNA 溶液使用天根cDNA 合成試劑盒(TIANscript RT Kit)進(jìn)行cDNA 合成，具體操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書，簡(jiǎn)要敘述如下:4 ul 5 ×緩沖液、2 ul 酶混合物、10 ul RNA酶滅活水和4 ul RNA 溶液配制成20 ul 體系，先在42 ℃下反應(yīng)60 min，再95 ℃下反應(yīng)5 min。將反應(yīng)生成的cDNA 8 ul、SYBR Green master mix (miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR)10 ul、PCR 混合液2 ul 共20 ul 在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(ABI7500)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃延伸30 s，72 ℃退火45 s，以上相同條件循環(huán)40 次。每例標(biāo)本進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)兩次，記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為Ct 值，兩次檢測(cè)的Ct 值取平均值作為每例樣本的最終Ct值，同時(shí)以U6snRNA 作為內(nèi)參其檢測(cè)Ct 值，目標(biāo)mRNA 表達(dá)量=2-△Ct，其中△Ct=CtmiR-CtU6。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本文所有的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。對(duì)樣本miR 表達(dá)量等定量資料采用正態(tài)性檢驗(yàn)，資料為正態(tài)分布，故使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組樣本間miR 表達(dá)量的比較采用方差分析LSD 法兩兩比較;兩組樣本間miR 表達(dá)量比較采用t 檢驗(yàn);采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析并繪制生存曲線，生存曲線兩組間比較采用log -rank 檢驗(yàn);采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行生存資料的多因素分析。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，p ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-10a、miR-93 和miR -200a 在正常卵巢組織、卵巢良性囊腫組織和卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)

miR-10a 在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)量高于正常卵巢組織和卵巢良性囊腫組織中的表達(dá)量，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p ＜0.001);miR-10a 在正常卵巢組織和卵巢良性組織中的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p ＞0.05);miR -93 和miR -200a 在正常卵巢組織、卵巢良性囊腫組織和卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p ＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 miR-10a、miR-93 和miR-200a 在正常卵巢組織、卵巢良性囊腫組織和卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)

2.2 卵巢惡性腫瘤組織中的miR -10a、miR -93 和miR -200a 表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系

miR-10a 表達(dá)量在有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤組織中高于無(wú)轉(zhuǎn)移者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p ＜0.05);miR-10a 表達(dá)量與卵巢惡性腫瘤細(xì)胞類型、臨床分期、分化程度、腹水量和是否有鉑類耐藥無(wú)明顯相關(guān)性，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)血液意義(p ＞0.05);miR -93 和miR-200a 表達(dá)量卵巢惡性腫瘤細(xì)胞類型、臨床分期、分化程度、是否有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移、腹水量和是否有鉑類耐藥等臨床病理特征均無(wú)明顯相關(guān)性，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p ＞0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 卵巢惡性腫瘤組織中的miR -10a 表達(dá)量與患者預(yù)后的關(guān)系

以miR-10a 表達(dá)量的中位數(shù)22.14 作為截?cái)嘀?，將miR-10a 表達(dá)水平分為高表達(dá)組(＞22.14)和低表達(dá)組(＜22.14)，使用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，log-rank 檢驗(yàn)顯示miR-10a 高表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間為29.40 個(gè)月，miR-10a 低表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間為49.35 個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p =0.01)(圖1)。采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示，臨床分期、分化程度、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移和miR-10a 表達(dá)量是卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(p ＜0.05);卵巢惡性腫瘤組織中miR -10a 表達(dá)量越高，患者預(yù)后越差。

圖1 miR-10a 表達(dá)量與卵巢癌生存率的關(guān)系

3 討論

Long MJ 等［7］發(fā)現(xiàn)miR-10a 在人類宮頸癌組織中顯著上調(diào)，同時(shí)在Hela 細(xì)胞和C33A 細(xì)胞中觀察到miR-10a 可以促進(jìn)細(xì)胞菌落的形成，遷移和侵襲。敲除CHL1 基因的Hela 細(xì)胞和C33A 細(xì)胞，會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞菌落的形成，遷移和侵襲能力，同時(shí)研究證實(shí)CHL1 基因是miR -10a 的靶基因，miR-10a 會(huì)下調(diào)CHL1 基因mRNA 水平以及CHL1 蛋白水平。Wang L 等［8］發(fā)現(xiàn)miR-93 和miR -200a 在宮頸癌組織中也是顯著增加，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲性有關(guān)。本研究經(jīng)過(guò)方差分析發(fā)現(xiàn)，miR-10a 在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)量顯著高于正常卵巢組織和卵巢良性囊腫組織中的表達(dá)量，而miR-93 和miR-200a 在正常卵巢組織、卵巢良性囊腫組織和卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-10a 的結(jié)果與前人研究是一致的，但是miR-93 和miR-200a 并沒(méi)有觀察到這種變化，可能的原因是我們的樣本量太小，沒(méi)有達(dá)到檢驗(yàn)出差異的效能;或者miR -93 和miR -200a 表達(dá)具有組織特異性，其只有在特定的腫瘤組織中才具有差異化表達(dá)。

Yan Y 等［9］研究發(fā)現(xiàn)miR-10a 通過(guò)抑制酪氨酸激酶A4受體的表達(dá)，介導(dǎo)原發(fā)性肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。Long MJ等［7］發(fā)現(xiàn)敲除CHL1 基因的Hela 細(xì)胞和C33A 細(xì)胞，會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞菌落的形成，遷移和侵襲能力，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)CHL1 基因是miR-10a 的靶基因，miR -10a 會(huì)下調(diào)CHL1 基因mRNA水平以及CHL1 蛋白水平。因此眾多研究都證實(shí)miR-10a通過(guò)抑制其靶基因的表達(dá)，參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)miR -10a 表達(dá)量在有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤組織中高于無(wú)轉(zhuǎn)移者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與上述腫瘤細(xì)胞學(xué)研究的結(jié)果時(shí)一致的。另外我們的研究還發(fā)現(xiàn)卵巢惡性腫瘤組織miR -10a 高表達(dá)的患者比低表達(dá)的患者中位生存時(shí)間更短，Cox模型多因素分析顯示，miR-10a 表達(dá)量是影響患者生存預(yù)后的獨(dú)立因素。其原因是高水平的miR -10a 導(dǎo)致了卵巢惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，以及對(duì)周圍和遠(yuǎn)處器官的侵襲，導(dǎo)致癌細(xì)胞擴(kuò)散至全身，從而加速了病情以及增加了治療難度。

表2 miR-10a、miR-93 和miR-200a 表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

表3 卵巢癌各臨床病理特征和miR-10a 表達(dá)量與患者預(yù)后的關(guān)系

總之，miR-10a 表達(dá)與卵巢癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，是影響卵巢癌預(yù)后的主要因素，可以作為判斷卵巢癌預(yù)后的標(biāo)志物。

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