兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞體外培養(yǎng)體會

摘要：骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節(jié)軟骨進行性退變病變慢性疾病，近些年發(fā)病率在不斷增高。基礎研究主要有各種原因引起的細胞數(shù)量過少而無法開展下去。在建立動物模型的基礎上更有效的提取軟骨細胞、體外培養(yǎng)對基礎研究做出最基本鋪墊，為臨床治療提供更有效的理論依據(jù)。本文通過軟骨的提取、軟骨的消化、細胞的收集、培養(yǎng)、鑒定，結合國內(nèi)外文獻做一綜述。

關鍵詞：骨關節(jié)炎；軟骨細胞；體外培養(yǎng)

軟骨組織﹙cartilage）由軟骨細胞﹙chondrocyte）和細胞外基質(zhì)﹙extracellularmatrix， ECM﹚構成，軟骨細胞是關節(jié)軟骨主要構成成分，主要功能是合成、分泌軟骨基質(zhì)，維持軟骨組織新陳代謝，是軟骨破壞過程中的靶細胞，因此軟骨細胞的體外培養(yǎng)是研究關節(jié)軟骨生理及病理的常用體外實驗模型，尤其是骨關節(jié)炎軟骨細胞的提取在研究治療骨關節(jié)炎、最基本最關鍵的一步[1]。自從1967年Manning[2]采用胰蛋白酶和細菌膠原酶聯(lián)合消化法獲得了高純度的軟骨細胞以來，為了獲得數(shù)量較多的軟骨細胞，軟骨細胞的提取、培養(yǎng)、傳代、鑒定，等不斷改進。但不同的動物，不同的模型對軟骨細胞的提取也有一定的不同。本文通過對兔膝骨關節(jié)炎造模成功后提取軟骨細胞進行培養(yǎng)、傳代、鑒定進一步認識兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞體外培養(yǎng)的要點及關鍵問題等。

1軟骨的提取

將實驗兔用空氣栓塞法處死，沿右膝關節(jié)正中縱行切開皮膚直至暴露出以膝關節(jié)為中心約6 cm×6 cm的區(qū)域，浸泡于75%的酒精中20～30 min，放入超凈臺中打開膝關節(jié)腔，無菌條件下用11號刀片（帶柄）削取膝關節(jié)股骨髁和脛骨平臺軟骨組織，將獲得關節(jié)軟骨組織，置入盛有含青霉素鈉/鏈霉素雙抗液 （1×1010U/L）的D-hanks液的無菌平皿中，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍，用眼科剪將軟骨組織剪成1mm3小塊，見圖1，然后再用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍。

在軟骨的提取過程中首先必須在無菌的條件下打開關節(jié)削取軟骨，我們總會最大量的削取更多的軟骨使得提取更多軟骨細胞，但更要主要的是①避免削取軟骨以外的組織，避免細胞提取還有其他組織細胞；②削取軟骨時不要削的太厚，可以一層層的削，這樣可以有助于軟骨的消化；③削取完后軟骨組織必須剪成1 m3小塊，有助于軟骨的消化，用緩沖液多清洗幾遍更好地去除血液、脂肪組織等其他組織。

2軟骨的消化

用0.25%胰蛋白酶先消化30～35 min，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍；加入0.2%Ⅱ型膠原酶（DMEM配制），置于37℃，體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)消化100 min，每30 min置37℃恒溫振蕩箱振蕩5 min。后抽取上清液用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾入離心管，800 r/min離心4min棄上清，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液洗兩遍每次800 r/min離心4min棄上清去除膠原酶。加入含12%胎牛血清DMEM 3 mL。用槍輕輕吹打可獲得單個軟骨細胞懸液。將軟骨細胞按1×105/L濃度接種于10 mL培養(yǎng)皿中，置于37℃，體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)皿中剩余的軟骨加入1%Ⅱ型膠原酶（DMEM配制） 置于37℃，體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)消化，每1 h置37℃恒溫振蕩箱振蕩5 min。倒置顯微鏡下觀察，軟骨細胞大部分分離后，用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾入離心管，800 r/min離心4 min棄上清，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液洗2遍800 r/min/次，離心4 min棄上清去除膠原酶。加入含12%胎牛血清DMEM 3 mL。用槍輕輕吹打可獲得單個軟骨細胞懸液。將軟骨細胞按1×105/L濃度接種于10 mL培養(yǎng)皿中，置于37℃，體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁達到85%～90%后傳代。

很多文獻中軟骨細胞消化都在3～6 h，然而軟骨細胞的消化時間要大大縮短，這也是兔膝骨關節(jié)炎模型的一個弊端，因為兔子的軟骨細胞消化時間過長越長細胞損傷越厲害，雖然有時我們在細胞計數(shù)時看到的都是活細胞，但放到培養(yǎng)瓶里樣上兩天基本上沒有貼壁的，軟骨細胞也是一種群居生活的物種，貼壁細胞越少增值能力越低。

3細胞的傳代及培養(yǎng)

軟骨細胞培養(yǎng)方法很多，包括單層培養(yǎng)法、三維培養(yǎng)法、離心管培養(yǎng)法、生物反應器等。其中單層培養(yǎng)法、三維培養(yǎng)法用的比較多，因三維培養(yǎng)法需要付出昂貴的費用本實驗采用單層培養(yǎng)法來培養(yǎng)兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞。軟骨細胞呈貼壁生長后，隨傳代次數(shù)增加，軟骨細胞發(fā)生去分化現(xiàn)象，限制了軟骨細胞的大量擴增。其中應該注意的是提取軟骨細胞時應用含12%～13%FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從第二代細胞開始改用含10%FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每3 d換液1次，細胞融合并覆蓋瓶底>80%時，用0.25%胰蛋白酶﹙含0.02%EDTA﹚消化，進行傳代培養(yǎng)。主要是因為開始時用含12%～13%FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)是因為可以使細胞更容易貼壁，而后改為含10% FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)是為了防止細胞早期就會出現(xiàn)\"去分化\"現(xiàn)象。實驗一般選用第三第四代細胞，其活性與增值能力最強。

細胞傳代時應注意的是胰蛋白酶消化時間不要過程，室溫一般30～60 s或用0.1%的胰蛋白酶。盡可能的減少細胞的損失。細胞離心600轉5 min，用槍吹打細胞時用力不要過猛。傳代后細胞損傷嚴重時主要表現(xiàn)是細胞增值能力下降或出現(xiàn)\"去分化\"現(xiàn)象，細胞的\"去分化\"現(xiàn)象主要表現(xiàn)在細胞的形態(tài)與分泌，細胞從多呈三角形、長梭形或多角形向圓形改變，分泌的Ⅱ型膠原以及蛋白多糖減少。

5細胞的鑒定

5.1軟骨細胞形態(tài)學觀察 在倒置顯微鏡下觀察，剛接種的軟骨細胞呈球形，24～48 h后開始貼壁生長，細胞多呈三角形、長梭形或多角形，72 h后細胞開始增殖，單層生長，彼此不相接觸。細胞增長至爬滿瓶底時軟骨細胞可變?yōu)閳A形，胞體豐滿，胞漿均勻，核大而圓并且互相連接成\"鋪路石\"樣結構。蘇木精-伊紅染色蘇木精-伊紅染色可見軟骨細胞呈三角形或多角形，細胞核呈紫藍色，可見明顯的雙核仁或多核仁形態(tài)，細胞基質(zhì)紅染，胞漿及細胞周圍有紫紅色或紅色異染出現(xiàn)[3]。

5.2Ⅱ型膠原蛋白 Ⅱ型膠原的合成和分泌是軟骨細胞維持其分化表型的特征性指標，可通過Ⅱ型膠原免疫熒光染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色來鑒定。Ⅱ型膠原免疫熒光染色﹙異硫氰酸熒光素FITC﹚可見胞漿和胞膜呈清晰綠色熒光，細胞核區(qū)域未見明顯綠色熒光，證明軟骨細胞特征性Ⅱ型膠原主要分布在胞漿和細胞膜上。Ⅱ型膠原免疫組化染色可見軟骨細胞胞漿被染成棕黃色，胞核不著色，胞外基質(zhì)中也有棕黃色顆粒出現(xiàn)[4]。

5.3蛋白聚糖蛋 白聚糖是軟骨細胞分泌的基質(zhì)成分，是軟骨細胞功能的主要指標，可通過甲苯胺蘭染色和阿利新藍﹙Alcianblue﹚染色進行鑒定。甲苯胺蘭染色可見軟骨細胞呈紫藍色，細胞基質(zhì)呈藍色，軟骨細胞內(nèi)及細胞周圍有藍紫色異染顆粒；阿利新藍染色可見軟骨細胞胞漿和胞膜呈深藍色，證明培養(yǎng)軟骨細胞分泌和合成蛋白聚糖[5]。

5.4 IL-1，TNF-α、MMP-13在細胞內(nèi)以及分泌表達在ELRSA試劑盒。

6展望

軟骨是一種特殊類型的結締組織，由軟骨細胞、軟骨基質(zhì)和纖維構成。軟骨細胞的功能為合成細胞外基質(zhì)大分子及各種酶類，而軟骨細胞外基質(zhì)主要有膠原和蛋白多糖聚集體組成。膠原中有間質(zhì)型膠原I、Ⅱ和Ⅲ，且Ⅱ型膠原為軟骨細胞的基因表達產(chǎn)物可用來確定軟骨細胞的表型[6]。

1965年Chesterman和Smith首次利用體外培養(yǎng)的軟骨細胞修復松質(zhì)骨和關節(jié)軟骨缺損，近30年來軟骨細胞體外培養(yǎng)在方法學上也取得了很大進 展[7]。軟骨細胞經(jīng)過培養(yǎng)所形成的結節(jié)樣結構，具有關節(jié)軟骨的生物學特征。軟骨細胞體外培養(yǎng)的方法是從細胞水平來探索關節(jié)軟骨生物學特性，為研究關節(jié)軟骨疾病的發(fā)病原理及其治療方法（包括藥物治療）提供了有效而簡便的方法。以細胞體外培養(yǎng)技術為基礎，在體外將軟骨細胞進行定向誘導分化，調(diào)節(jié)細胞的增殖及凋亡等方面的研究，有助于研究治療某些退行性疾病的藥物，因此具有廣闊的應用前景。

因骨性關節(jié)炎軟骨細胞處于退變期，細胞周期較正常軟骨細胞周期要短，其可能原因： 骨性關節(jié)炎軟骨細胞為變性軟骨細胞，細胞功能的改變可能影響細胞周期的變化[8]。損傷的骨性關節(jié)炎軟骨中，軟骨細胞代謝活躍，相伴隨的細胞分泌的各種胞外基質(zhì)也相應高表達，軟骨代謝的異常，導致胞外基質(zhì)成分的異常，軟骨細胞生存環(huán)境改變促使軟骨細胞過早的死亡，加劇骨性關節(jié)炎的進程；骨性關節(jié)炎軟骨細胞中混雜有纖維軟骨細胞，纖維軟骨細胞增殖速度明顯較軟骨細胞快，必將影響細胞周期的變化[9-10]。

體外培養(yǎng)軟骨細胞是研究軟骨分化、增殖以及軟骨病變的一種常用模型，也是軟骨組織工程的基礎。目前體外軟骨細胞的培養(yǎng)技術已經(jīng)日漸成熟，可從許多動物及人的不同軟骨組織中分離培養(yǎng)軟骨細胞，但是軟骨細胞的體外培養(yǎng)方法均存在一定的局限性，培養(yǎng)條件還有待進一步完善。另外，軟骨細胞分化、增殖過程中受到多種調(diào)控因子的調(diào)控，其相互作用機制復雜，對軟骨細胞體外培養(yǎng)的影響還有待進一步的深入研究。

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編輯/張燕