骨髓間充質(zhì)干細胞與納米晶膠原基骨復合體修復犬股骨頭壞死模型的實驗研究

摘要：目的 探索骨髓間充質(zhì)干細胞與納米晶膠原基骨復合體在骨壞死修復中的效果。方法 制備骨髓間充質(zhì)干細胞與納米晶膠原基骨復合體，取23只雜種犬建立雙側(cè)股骨頭壞死動物模型，隨機分為三組?？瞻捉M不做任何治療；單純納米骨植入組植入納米骨；納米骨+骨髓間充質(zhì)干細胞組植入復合了干細胞的納米骨。對植入后4、8、12w的股骨頭行影像學觀察以及組織學觀察。結(jié)果 X射線檢查：植入后12w，空白組犬股骨頭有塌陷；單純納米骨植入組充填區(qū)與周圍組織區(qū)別不明顯，周邊有新生骨小梁；納米骨+骨髓間充質(zhì)干細胞復合體植入組充填區(qū)近似周圍組織，充填區(qū)分布有骨小梁。組織學觀察：4w時，空白組股骨頭壞死區(qū)無明顯變化，其他兩組植入物降解和新骨替代；8w時，空白組股骨頭負重區(qū)軟骨面部分缺損，其他兩組壞死區(qū)初步修復，可見成骨和材料降解；12w時，空白組壞死區(qū)仍未修復，部分股骨頭有塌陷，其他兩組壞死區(qū)修復，納米骨+骨髓間充質(zhì)干細胞植入組骨小梁結(jié)構(gòu)形成。結(jié)論 單純納米骨植入組和納米骨+骨髓間充質(zhì)干細胞植入組在股骨頭壞死成骨方面效果優(yōu)于空白組，納米骨+骨髓間充質(zhì)干細胞植入組成骨更佳。骨髓間充質(zhì)干細胞與納米晶膠原基骨復合體對早期股骨頭壞死的治療有較好的應用前景。

關鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細胞；納米晶膠原基骨；股骨頭壞死；犬

股骨頭壞死是一種對髖關節(jié)具有特殊破壞性的退行性病變，病程長且致殘率高，嚴重危害人民的健康。對于成人早期股骨頭壞死，行人工關節(jié)置換尚為期過早，因此如何有效地防止疾病的進一步發(fā)展，保護股骨頭，延緩髖關節(jié)置換的手術時間，是值得關注的問題。股骨頭壞死早期病程長，在進展至退行性髖關節(jié)病變晚期的3～5年間是可以逆轉(zhuǎn)的，早期發(fā)現(xiàn)并給予一種安全、有效、微創(chuàng)的治療是醫(yī)患雙方共同追求的目標。

骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）是一類存在于骨髓基質(zhì)中的多能成體干細胞，大量研究證明BMSCs不僅具有良好的成骨細胞分化潛能和高成骨活性，還可分化成為軟骨細胞、脂肪細胞等多種間葉組織細胞。另外BMSCs具有獲取方便，易于體外純化擴增，易于基因修飾，不存在免疫排斥問題等優(yōu)點。因此，BMSCs是目前骨組織工程的最佳種子細胞[1]。骨壞死的病理轉(zhuǎn)歸中，血液供應的中斷是最終引起臨床改變的決定因素。清除壞死病灶并盡可能重建血供是治療骨壞死的重要手段。在缺血壞死區(qū)，當病灶清除后，骨修復區(qū)的血供重建則依賴于毛細血管網(wǎng)的新生。但由于患者從病變侵害形成至骨壞死出現(xiàn)均已經(jīng)過長期的病程，局部的修復環(huán)境已發(fā)生了改變，缺乏利于血管形成的微環(huán)境，從而造成了患者即使充填了有效植骨材料，仍無法迅速及早期建立血供，進而影響其最終的療效[2]。實驗利用現(xiàn)代分子生物學、組織工程學的研究進展，針對骨壞死病理學特點：局部骨組織血供中斷、BMSCs成骨分化能力減退，構(gòu)建適于骨壞死治療的骨移植替代物，提高早期骨壞死的治療效果。在分離純化犬BMSCs基礎上，將BMSCs與納米晶膠原基骨（nHAC）修復材料復合構(gòu)建組織工程骨，為組織工程技術治療骨壞死提供理論與實驗依據(jù)，探索提高髓芯減壓植骨術治療骨壞死成功率的新途徑。

1 資料與方法

1.1一般資料 健康成年雜種犬23只，18～24月齡，體質(zhì)量（17.0±0.5）kg，雌11只雄12只，來源于連云港市東?？h種犬養(yǎng)殖場，普通環(huán)境。隨機對照動物實驗過程中對動物處置符合科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2方法 BMSCs與納米骨復合體的制備：取實驗雜種犬骨髓分離培養(yǎng)BMSCs。nHAC在PBS中漂洗30min共3次，在95%的乙醇中浸泡2h，用無菌濾紙吸去多余液體。取第3代BMSCs長滿后，消化細胞并將細胞配成2×109/L細胞懸液，D-Hanks液沖洗后，用2.5 g/L的胰酶+0.01%的EDTA消化，吹打后離心，以1500r/min轉(zhuǎn)速離心10min，去上清，加入少量培養(yǎng)液，振蕩后計數(shù)，制成濃度為1×109/L的細胞懸液。將材料放于96孔板內(nèi)，1粒/孔，復合于2.5mm×2.5mm×2.5mm納米骨上。每孔接種上述細胞懸液200μL進行BMSCs與nHAC的復合培養(yǎng)，37℃體積分數(shù)為5%CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，2～3d換液1次，備用[3]。

1.3動物分組 取造模成功后的股骨頭壞死模型犬23只（骨膜部分剝離+髓腔破壞法成形左、右后肢股骨頭壞死模型），隨機分為空白組11只、單純納米骨植入組11只、納米骨+BMSCs復合體植入組11只。造模及治療方法：術區(qū)備皮后以30g/L戊巴比妥鈉麻醉，取俯臥位，常規(guī)消毒、鋪巾，髖關節(jié)后側(cè)切口，從臀大肌與闊筋膜張肌之間進入，切斷外旋肌群，暴露關節(jié)囊，外旋股骨，顯露股骨頭，不切斷圓韌帶，髖關節(jié)不脫位，保護周圍組織，從股骨頸內(nèi)后側(cè)向股骨頭內(nèi)鉆孔。用直徑為3mm鉆頭向股骨頭內(nèi)鉆入約5.5mm，到達關節(jié)軟骨下?？瞻捉M不做任何治療，常規(guī)關閉傷口；單純納米骨植入組在所鉆空內(nèi)植入一2.5mm×2.5mm×2.5mm納米骨，常規(guī)關閉傷口；納米骨+BMSCs組在所鉆孔內(nèi)植入一2.5mm×2.5mm×2.5mm復合了干細胞的納米骨，常規(guī)關閉傷口。術后給予青霉素鈉肌注3d，6×104U/kg，1次/d，預防感染。

1.4檢測指標 ①大體觀察：實驗動物術后一般情況觀察。普通X射線成像觀察：各組實驗動物術后4、8、12w的股骨頭攝X射線片，觀察股骨頭外形變化情況。②組織學觀察：術后12w，空氣栓塞法處死動物，標本經(jīng)處理后進行蘇木精-伊紅染色、Massion染色和免疫組織化學檢測VEGF。③主要觀察指標：①犬術后大體觀察。②各組犬術后X射線觀察。③各組犬術后組織學觀察。

2 結(jié)果

2.1實驗動物數(shù)量分析 實驗選用健康成年雜種犬23只，造模成功23只，分為3組，術后無死亡，進入結(jié)果分析23只。

2.2犬術后大體觀察 結(jié)果實驗動物麻醉清醒后正常飼養(yǎng)。術后6h即正常飲水進食、正?；顒樱瑹o跛行或癱瘓。其中5例術后出現(xiàn)傷口紅腫，后自行愈合，其他犬切口均Ⅰ期愈合。

2.3各組犬術后X射線觀察 空白組：4w股骨頭無明顯變化，8w股骨頭負重區(qū)軟骨面部分缺損，12w部分犬股骨頭有塌陷。單純納米骨植入組：術后4w充填區(qū)材料與周圍組織結(jié)合松散，周邊有反應帶；8w后，充填材料與周圍組織邊界模糊；12w充填區(qū)與周圍組織區(qū)別不明顯，界限不清楚，周邊有新生骨小梁。納米骨+BMSCs復合體植入組：術后4w充填區(qū)界限清楚，周邊有一明顯的反應帶；8w周邊反應帶基本消失，開始有骨小梁長入充填區(qū)；12w充填區(qū)近似周圍組織，無明顯界限，整個充填區(qū)已分布有骨小梁，且排列基本規(guī)則。

2.4各組犬術后組織學觀察結(jié)果 空白組：術后4w，骨小梁稀疏變細，結(jié)構(gòu)紊亂，有碎片出現(xiàn)，骨小梁骨細胞陷窩空疏；8w后，骨小梁進一步萎縮，結(jié)構(gòu)紊亂并出現(xiàn)大量斷裂骨小梁，偶可見骨小梁缺如，無新生骨小梁出現(xiàn)。12w，骨小梁大量崩解，可見較大范圍骨小梁缺失區(qū)域，無新生骨組織充填，骨髓纖維化變性，可見到股骨頭塌陷現(xiàn)象，塌陷股骨頭周圍纖維組織包裹。

納米骨植入組：術后4w，周邊有少量成骨反應，新生組織向中心部長入；8w，周邊有一定量骨形成，周邊為骨形成帶；12w，材料與周圍組織邊界模糊，材料中骨組織長入，材料少量降解，骨小梁替代，偶有新生骨髓腔形成。

納米骨復合BMSCs植入組：術后4w，充填區(qū)周圍有肉芽組織形成，間充質(zhì)細胞大量增生，新生組織開始呈網(wǎng)狀長入充填物，周邊有明顯的成骨反應，有較多的新骨形成，纖維肉芽樣組織向nHAC長入；8w時，周邊新骨帶明顯增寬，成骨反應向中心部推進，材料降解速度遠快于納米骨植入組；12w時，部分充填區(qū)為幼稚的骨小梁所占據(jù)，表面有較多的成骨細胞，部分充填區(qū)廣布相對較成熟的骨小梁，但較正常骨小梁粗、排列不夠規(guī)則，大量板層骨和新生骨髓腔形成，材料大部分降解。

3 討論

干細胞治療股骨頭壞死應嚴格掌握適應證，一般選擇病變早期患者，早期病例指具有完好外形的股骨頭，根據(jù)ARCO分期，應為I期II期病例\"不應該有明顯的囊性改變，III期病例由于有股骨頭的塌陷，即使手術后有成骨表現(xiàn)，也難以阻止病變進一步發(fā)展至骨關節(jié)炎。目前對于骨髓間充質(zhì)干細胞治療股骨頭壞死機制的研究還僅限于由多能干細胞向成骨細胞或血管內(nèi)皮細胞分化這一環(huán)節(jié)上，對于壞死各階段的病理過程還可以在干細胞水平做更為深入的探索。

BMSCs是骨組織工程最佳的種子細胞 本實驗采用BMSCs作為種子細胞構(gòu)建組織工程骨，并移植到骨壞死區(qū)域治療骨壞死，具有明顯優(yōu)勢。BMSCs不僅可以促進血管形成，還可旁分泌多種細胞因子促進血管再生。從而建立血管形成的良性循環(huán)，促進組織工程骨的快速血管化，同時阻斷因缺血造成的骨壞死病理轉(zhuǎn)歸。對于骨壞死的診斷，普通X射線檢查是常規(guī)方法，但對其早期診斷價值不大。本實驗中普通X射線主要用于觀察股骨頭壞死晚期的塌陷情況和局部骨小梁形成情況。實驗采用的支架材料為nHAC，是在仿生的思路下和既有膠原-鈣磷鹽復合材料的基礎上制備的一種新型納米復合骨材料。在微結(jié)構(gòu)和成分兩方面都與天然骨有相似性，納米級的羥基磷灰石為主要礦物相；礦物與膠原分子自組裝成周期排列結(jié)構(gòu)；材料的孔隙結(jié)構(gòu)與松質(zhì)骨相同，孔隙率70%以上；分級結(jié)構(gòu)與天然骨相同.該材料化學性能和物理性能均符合人體內(nèi)環(huán)境要求，具有良好的生物相容性。本實驗組織學結(jié)果顯示，nHAC在股骨頭局部病理環(huán)境中有誘導成骨活性的能力，不斷長入充填區(qū)的新生組織含有大量具有成骨潛能的細胞，作用于新骨，隨著逐漸的降解，nHAC被形成的新骨所替代，說明這種nHAC不僅能有效地提高骨壞死病理條件下股骨頭的骨修復能力，同時適宜新生組織的長入并能很好地完成材料的骨替代過程。因此，nHAC具有較好的生物相容性和生物可降解性，有可能成為組織工程的優(yōu)良載體。復合BMSCs的nHAC在成骨方面更強。術后4w即有明顯的成骨反應和新骨形成，比單純植入nHAC組成骨反應出現(xiàn)早且成骨能力明顯提高。隨著活組織的長入和材料的逐漸降解，新骨形成不斷向中心部延伸，12w基本修復了股骨頭的骨缺損區(qū)。臨床上采用BMSCs復合nHAC將為股骨頭壞死\"保留股骨頭\"治療提供新的材料、思路和方法，對早期股骨頭壞死的治療有較好的應用前景。隨著分子生物學和細胞生物學的迅速發(fā)展，骨髓間充質(zhì)干細胞的研究也會更加深入，促進、支持骨髓間充質(zhì)干細胞生長分化成熟的各種生物因子，模擬體內(nèi)微環(huán)境的細胞外基質(zhì)，將骨髓間充質(zhì)干細胞有效的分布在股骨頭壞死局部等均將成為研究熱點，并將取得重大突破，從而為股骨頭壞死的微創(chuàng)治療開辟新的紀元。

參考文獻：

[1] Kerachian MA， Harvey EJ， Cournoyer D， et al. Avascular necrosis of the femoral head：vascular hypotheses.Endothelium.2006；13（4）：237-244.

[2]Jiang F， Huang CL， Cheng X. Jiefangjun Yixue Zazhi.2007；32（12）：1232-1235.

[3]Fukuchi Y， Nakajima H， Sugiyama D， et al. Human placent aderivedcell shave mesenchymal stem progenit or cell potential.Stem Cells.2004；22（5）： 649-658.

編輯/許言