Daxx反義寡核苷酸在全腦缺血/再灌損傷中作用機(jī)制的研究

摘要：目的 檢測(cè)Daxx反義寡核苷酸在大鼠海馬全腦缺血/再灌介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中作用機(jī)制的研究。方法 采用SD大鼠四動(dòng)脈結(jié)扎全腦缺血模型，于缺血前連續(xù)3d腦室注射Daxx反義寡核苷酸，用免疫印跡方法研究Daxx反義寡核苷酸在大鼠海馬全腦缺血/再灌介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中對(duì)Daxx/Ask1信號(hào)通路的影響。結(jié)果 在海馬的CA1區(qū)，Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制腦缺血介導(dǎo)的Daxx的核轉(zhuǎn)位以及Ask1磷酸化的升高。結(jié)論 缺血前3d連續(xù)腦室注射Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制Daxx/Ask1介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

關(guān)鍵詞：腦缺血/再灌；反義寡核苷酸；Daxx；Ask1

腦血管疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)病，因此研究其發(fā)病的分子機(jī)制具有極其重要的意義[1]。死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（death domain associated protein， Daxx）在核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控子發(fā)揮促凋亡作用[2]，在各種凋亡刺激下，Daxx可以從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿中，從而啟動(dòng)不同的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞的凋亡。

凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）是MAPKKK家族中的一個(gè)成員，可以分別激活MKK4/7-JNK和MKK3/6- p38信號(hào)通路[3-5]而引起細(xì)胞的凋亡。在腦缺血信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中ASK1信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是重要的致凋亡信號(hào)通路[6-8]。

1 資料和方法

1.1一般資料 雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠，250～300g，清潔級(jí)，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 SD大鼠腦缺血/再灌模型的建立 按本室已建立的大鼠四動(dòng)脈結(jié)扎全腦缺血模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有機(jī)分為假手術(shù)組、缺血/再灌組、溶劑對(duì)照組和給藥組。動(dòng)物以20%水合氯醛（300～350mg/kg）腹腔注射麻醉后，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并電凝椎動(dòng)脈。手術(shù)第2d動(dòng)物于清醒狀態(tài)下結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，使全腦缺血15min，然后再灌注不同時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用方差分析（ANOVA），實(shí)驗(yàn)組之間比較采用Sigma Stat統(tǒng)計(jì)軟件，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制腦缺血/再灌介導(dǎo)的海馬CA1區(qū)Daxx蛋白在胞漿中的表達(dá) 生理情況下，Daxx主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，在各種凋亡刺激下，Daxx出核轉(zhuǎn)位到胞漿內(nèi)。以前的研究結(jié)果表明Daxx在胞漿內(nèi)的表達(dá)在缺血復(fù)灌后明顯升高，分別在復(fù)灌3h和3d達(dá)到高峰。我們選擇腦缺血復(fù)灌后3h的海馬CA1區(qū)細(xì)胞漿部分來(lái)檢測(cè)Daxx反義寡核苷酸對(duì)Daxx蛋白表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制CA1區(qū)胞漿內(nèi)Daxx表達(dá)的升高。而溶劑對(duì)照和Daxx錯(cuò)義寡核苷酸組對(duì)其沒(méi)有影響（如圖1）。

2.2 Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制腦缺血再灌早期ASK1-Thr845的磷酸化 既然Daxx反義寡核苷酸能夠抑制Daxx的核轉(zhuǎn)位，那么它對(duì)下游激酶ASK1是否也有作用？我們以前的結(jié)果顯示在腦缺血/復(fù)灌刺激后海馬CAI區(qū)ASK1的磷酸化逐漸升高，并形成兩個(gè)活化高峰，分別在復(fù)灌3h和3d[9]。我們選擇復(fù)灌3h的海馬組織為研究對(duì)象檢查藥物對(duì)ASK1的影響。與溶劑對(duì)照組和錯(cuò)義寡核苷酸組相比，Daxx反義寡核苷酸可以使ASK1-Thr845的磷酸化顯著降低，而ASK1的蛋白表達(dá)沒(méi)有受到影響（如圖2）。

3 討論

Daxx最初是被作為Fas相互作用蛋白而被發(fā)現(xiàn)的[10]。Fas的活化誘導(dǎo)Daxx和ASK1之間的相互作用，Daxx抑制ASK1分子內(nèi)氨基末端和羧基末端的相互作用，激活A(yù)SK1，從而活化JNK通路.在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先通過(guò)免疫印跡方法來(lái)檢測(cè)在大鼠海馬CA1區(qū)胞漿內(nèi)全腦缺血復(fù)灌過(guò)程中Daxx的表達(dá)。結(jié)果顯示，Daxx蛋白在胞漿內(nèi)的表達(dá)在全腦缺血復(fù)灌后明顯升高。我們接著檢測(cè)Ask1在全腦缺血復(fù)灌過(guò)程中的蛋白表達(dá)和磷酸化的變化。結(jié)果表明，缺血/復(fù)灌后ASK1的磷酸化逐漸升高，但蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化。那么Daxx的核轉(zhuǎn)位與Ask1之間究竟有什么聯(lián)系呢？帶著這個(gè)疑問(wèn)，我們?cè)谌毖斑B續(xù)3d腦室注射Daxx反義寡核苷酸來(lái)檢測(cè)Daxx與Ask1之間的關(guān)系。我們驚喜的發(fā)現(xiàn)Daxx反義寡核苷酸可以明顯的抑制Daxx的核轉(zhuǎn)位以及Ask1磷酸化的升高，相反，Daxx錯(cuò)義寡核苷酸組以及容積對(duì)照組對(duì)其沒(méi)有影響。說(shuō)明，在大鼠海馬CA1區(qū)全腦缺血復(fù)灌過(guò)程中可以引起Daxx從胞核到胞漿的轉(zhuǎn)位，并進(jìn)一步引起Ask1的磷酸化，而Daxx反義寡核苷酸可以明顯抑制這一過(guò)程的進(jìn)行，最終抑制Daxx-Ask1所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這對(duì)我們今后進(jìn)一步研究Daxx在大鼠海馬全腦缺血復(fù)灌過(guò)程中的作用具有重要的意義。

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編輯/王敏