Hcy對巨噬細胞膽固醇流出的影響及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制的研究

摘要：目的 探討同型半胱氨酸 （Homocysteine，Hcy）對巨噬細胞膽固醇流出的影響及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用機制。方法 培養(yǎng)THP-1單核細胞源性巨噬細胞后，分別用不同濃度的Hcy（50、100、200、500 M）處理24h，以未加Hcy的細胞作為對照組，以100 M Hcy+葉酸+維生素B12（VB12） 作為干預組。結(jié)果 Hcy可以減少巨噬細胞內(nèi)膽固醇的流出，與對照組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但并不呈量效關系。干預組與100 M Hcy 組相比TC含量降低，ox-LDL及GRP78、XBP-1、CHOP含量下降，差異有顯著性（P<0.05）。結(jié)論 Hcy使巨噬細胞內(nèi)膽固醇的流出受阻，并通過上調(diào)ox-LDL含量誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

關鍵詞：同型半胱氨酸；THP-1單核細胞源性巨噬細胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）是一類以脂代謝異常和炎癥反應為主的復雜性病變，其與脂質(zhì)沉積、炎性細胞浸潤、局部血栓形成及氧自由基產(chǎn)生增多有關。本研究以THP-1單核細胞源性的巨噬細胞為研究對象，用不同濃度的Hcy干預后觀察膽固醇流出和ox-LDL的含量，并檢測ERS相關蛋白的表達，為進一步揭示Hcy在動脈粥樣硬化中的作用提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 THP-1單核細胞株由本實驗室保存；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；總膽固醇檢測試劑盒為北京北化康泰臨床試劑有限公司產(chǎn)品；GRP78、CHOP、XBP-1 及ox-LDL檢測試劑盒為Groundwork Biotechnology Diagnosticate 公司產(chǎn)品；Hcy、佛波酯（PMA）為Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑為國產(chǎn)分析純[1]。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 取本實驗室液氮中凍存的THP-1單核細胞株復蘇后，用含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。待細胞融合到80%～90%時，每瓶加入含500nM 佛波酯（PMA）的培養(yǎng)液孵育48h，誘導單核細胞分化成巨噬細胞。實驗分組：①對照組：以不加Hcy巨噬細胞為空白對照組（0 M Hcy）。②實驗組：在巨噬細胞中分別以50、100、200、500 M Hcy處理細胞，③干預組：100 M Hcy+葉酸+維生素B12（VB12），各組分別培養(yǎng)24 h后檢測后續(xù)指標。

1.2.2 TC的測定 采用酶法測定巨噬細胞TC含量，按照試劑盒說明書操作，分別檢測各組TC水平。

1.2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應蛋白的測定 各組細胞孵育后，收取并裂解細胞，取細胞上清液后，按照ELISA試劑盒說明書測定各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應蛋白（CHOP、XBP-1、GRP78）的含量。

1.2.4 ox-LDL含量的測定 反復凍融細胞，離心后取細胞上清液用ELISA法測定細胞內(nèi)ox-LDL 的含量，按照ELISA試劑盒說明書依次測量各孔OD值，記錄并分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 結(jié)果以x±s表示，應用SPSS11.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，兩樣本均數(shù)間比較采用Student's t檢驗，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 THP-1單核細胞源性巨噬細胞的培養(yǎng) THP-1單核細胞是懸浮生長的細胞，細胞形態(tài)規(guī)則、大小均一、胞膜完整（圖1A）。經(jīng)PMA誘導48h后在顯微鏡下觀察顯示此時細胞呈貼壁狀態(tài)，形狀不規(guī)則并有偽足伸出的巨噬細胞（圖1B）。

2.2 Hcy對巨噬細胞內(nèi)總膽固醇含量變化 不同濃度的Hcy干預人THP-1單核細胞源性巨噬細胞24h后，與對照組相比，各實驗組巨噬細胞內(nèi)膽固醇聚集顯著增加，尤其是以100 M Hcy組TC升高最明顯，差異有顯著性（P<0.01），但TC含量與Hcy濃度無明顯量效關系。而干預組TC含量比100 M Hcy組TC值有所下降（P<0.05），見圖2。

2.3 Hcy 對巨噬細胞內(nèi)ox-LDL 的影響 與對照組比較，不同濃度Hcy干預后THP-1巨噬細胞內(nèi)ox-LDL的含量均有所增加，以100 MHcy組最明顯，差異有顯著性 （P<0.01）。ox-LDL的含量與Hcy濃度無量效關系。與100 MHcy組比較，干預組巨噬細胞內(nèi)ox-LDL的含量明顯減少（P<0.01），見圖3。

3 討論

同型半胱氨酸 （Homocysteine，Hcy）被認為是AS的獨立危險因素，其機制與內(nèi)皮細胞損傷、氧化應激、脂代謝紊亂等有關。不同濃度Hcy干預THP-1源性巨噬細胞后發(fā)現(xiàn)，隨著Hcy濃度升高，巨噬細胞內(nèi)TC含量升高，表明Hcy也可以促使巨噬細胞發(fā)生泡沫化，推測Hcy抑制了巨噬細胞內(nèi)膽固醇的流出，使細胞內(nèi)膽固醇異常增加并導致脂質(zhì)的堆積，從而介導了泡沫細胞的形成和AS的發(fā)生發(fā)展。

Hcy不僅影響脂代謝，它本身是蛋氨酸循環(huán)過程的中間代謝產(chǎn)物，含有活潑而自由的巰基，容易發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)生大量的H2O2和O2-，過量的活性氧使LDL氧化生成ox-LDL。ox-LDL通過增加炎性細胞因子的表達、增強細胞毒性反應、抑制誘導型一氧化氮合酶的產(chǎn)生。本實驗探討了Hcy對巨噬細胞膽固醇流出的影響及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用機制，進一步補充和完善了Hcy引起動脈粥樣硬化的機制。

參考文獻：

[1]姚樹桐，?；郏瑮钅饶?，等. 氧化低密度脂蛋白誘導巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及CD36的可能作用[J]， 生理學報， 2010， 62 （5）： 433-440.編輯/王敏