α—黑素細(xì)胞刺激素對EAE豚鼠外周血單個核細(xì)胞分泌IL—4、IFN—γ水平的影響

摘要：目的 通過研究α-黑素細(xì)胞刺激素（α-MSH）對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）豚鼠分泌IL-4、IFN-γ水平的影響，探討α-MSH對EAE發(fā)病有無保護(hù)作用。方法 40只雌性豚鼠分為正常對照組、EAE對照組和EAE高、低劑量治療組。兩治療組自造模前7 d始分別按1 mg/Kg/d及0.25 mg/Kg/d予腹腔注射注射α-MSH直至試驗(yàn)結(jié)束。觀察豚鼠神經(jīng)功能障礙評分變化，測定IL-4、IFN-γ水平。結(jié)果 ①α- MSH治療組神經(jīng)功能障礙評分較EAE對照組顯著降低（P<0.01，P<0.05），高劑量治療組改變更明顯（P<0.05）。②a-MSH治療組分泌IFN-γ水平較EAE對照組降低（P<0.01，P<0.01），分泌IL-4水平較EAE對照組升高（P<0.01，P<0.01）；a-MSH高劑量治療組比低劑量治療組升高或降低更明顯。③各組IFN-γ/IL-4比值與與神經(jīng)功能障礙評分呈正相關(guān)（P<0.01）。結(jié)論 α-MSH對EAE豚鼠發(fā)病具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制之一可能是通過劑量依賴性地調(diào)節(jié)IFN-γ/IL-4平衡發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的。

關(guān)鍵詞：α-黑素細(xì)胞刺激素；腦脊髓炎；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性；白細(xì)胞介素-4；γ-干擾素

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）是經(jīng)典的多發(fā)性硬化動物模型。目前研究認(rèn)為EAE發(fā)病機(jī)制免疫失衡有關(guān)，Th1型細(xì)胞因子-γ干擾素（IFN-γ）與Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4（IL-4）在其發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[1]。

α-黑素細(xì)胞刺激素（Alpha-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH） 是一種前阿片促皮質(zhì)激素原（Proopiomelanocortin，POMC）衍生肽，一系列動物實(shí)驗(yàn)表明α-MSH對皮炎、炎癥性腸病、支氣管哮喘等多種炎癥性疾病具有治療作用[2-3]，但國內(nèi)尚無用于EAE和MS的相關(guān)報(bào)道。本研究試圖通過觀察α-MSH對EAE神經(jīng)功能障礙評分及相關(guān)細(xì)胞因子的影響，探討EAE發(fā)病及α-MSH治療EAE的機(jī)制。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及主要實(shí)驗(yàn)試劑 250～300 g雌性健康豚鼠40只和健康SD大鼠5只； 福氏完全佐劑（complete Freud's adjuvant，CFA）、α-MSH、鼠IL-4、IFN-γ ELISA試劑盒；淋巴細(xì)胞分離液[比重（1.07土0.002）g/mL]等。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理 40只雌性豚鼠隨機(jī)分為4組，正常對照組、EAE對照組、EAE低劑量治療組、EAE高劑量治療組，每組各10只。取SD大鼠脊髓制成脊髓冰生理鹽水勻漿，再與等量福氏完全佐劑混合，反復(fù)抽打制成粗制髓鞘堿性蛋白（crude myelin basic protein，cMBP），將其注入需造模豚鼠雙側(cè)后足掌皮下各0.3 mL制造EAE模型。用PBS液稀釋α-MSH成0.25 mg/mL、1 mg/mL兩種濃度的溶液，EAE低、高劑量治療組自造模前7 d始分別予腹腔注射注射α-MSH；EAE對照組及正常對照組分別同時(shí)腹腔注射等體積PBS液和生理鹽水，直至實(shí)驗(yàn)終止。造模成功后，每天同一時(shí)間對豚鼠進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：無明顯異常0分，后肢輕癱1分，后肢完全癱瘓2分，后肢全癱伴前肢不完全癱瘓3分，四肢完全癱瘓或死亡為4分。各EAE組動物均造模成功，觀察3 d癥狀不再加重為發(fā)病高峰期處死動物；正常對照組動物4 w后處死。

1.2.2 IFN-γ、IL-4水平的測定 將肝素抗凝的眶靜脈血分離單個核細(xì)胞，調(diào)成2×106/mL的濃度，用RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮，在上述淋巴細(xì)胞懸液中加入1mg/ml的PHA，充分混勻后加入24孔培養(yǎng)板中，然后置于5%的CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，ELlSA法檢測IFN-γ、IL-4水平（按說明書方法進(jìn)行檢測）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析；組間兩兩比較用LSD法；變量間相互關(guān)系采用Pearson直線相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能障礙評分 各造模組均有不同程度發(fā)病，正常對照組豚鼠未發(fā)病。EAE對照組（3.4±0.6）分，EAE低劑量治療組（2.7±0.7）分，高劑量治療組（2.1±0.6）分，兩治療組神經(jīng)功能障礙評分低于EAE對照組（P<0.05，P<0.01）。EAE高劑量治療組評分低于低劑量治療組（P<0.05）。

2.2各組豚鼠外周血單個核細(xì)胞分泌 IFN-γ、IL-4水平的比較，見表1。

2.3 EAE對照組及高、低劑量治療組發(fā)病高峰期IFN-γ/IL-4比值與神經(jīng)功能障礙評分相關(guān)性分析 EAE對照組及兩治療組發(fā)病高峰期外周血IFN-γ/IL-4比值與神經(jīng)功能障礙評分呈正相關(guān)（r=0.89，P<0.01、r=0.89，P<0.01、r=0.81，P<0.01）。

3討論

Th1細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫，介導(dǎo)與細(xì)胞毒性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)有關(guān)的免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞主要參與體液免疫應(yīng)答。Th1細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子有IL-2、INF-γ和腫瘤壞死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）等，這些細(xì)胞因子能夠觸發(fā)細(xì)胞免疫，使炎性細(xì)胞轉(zhuǎn)移至CNS內(nèi)從而加劇髓鞘破壞過程；Th2細(xì)胞則主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，具有抗炎作用，因而認(rèn)為MS是Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主的疾病[1]。正常情況下，Th1和Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子處于動態(tài)平衡中，并受到機(jī)體的嚴(yán)格調(diào)控，各種原因?qū)е耇h1/Th2細(xì)胞因子失衡可導(dǎo)致自身免疫性疾?。ㄈ缍喟l(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）的發(fā)生[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)中，通過對EAE豚鼠外周血中最具代表性的Th1、Th2型細(xì)胞因子IFN-γ及IL-4的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)病高峰期，EAE對照組豚鼠外周血單個核細(xì)胞分泌IFN-γ水平比正常對照組顯著增高（P<0.01），分泌IL-4的水平較正常組顯著降低（P<0.01）。進(jìn)一步相關(guān)分析結(jié)顯示：IFN-γ/IL-4比值與EAE豚鼠神經(jīng)功能障礙評分呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EAE體內(nèi)存在Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡，即Th1細(xì)胞過度活化，Th2細(xì)胞功能受抑制，Th細(xì)胞分化向Th1極偏移，且失衡程度與神經(jīng)功能障礙的嚴(yán)重程度相關(guān)。

多種肽類激素具有一定免疫保護(hù)作用，而α-MSH是一種POMC衍生肽，其受體分布廣泛，除黑色素細(xì)胞外還分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞，表明α-MSH應(yīng)該對機(jī)體免疫功能有一定影響。研究發(fā)現(xiàn)α-MSH可以減輕棒狀桿菌和脂多糖誘導(dǎo)的肝炎的炎性強(qiáng)度；抑制接觸型皮炎的激發(fā)，引起特異的半抗原耐受；對支氣管哮喘、脈管炎、炎癥性腸病等多種免疫性疾病具有抑制發(fā)生或減輕損害作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，α-MSH能夠減輕EAE豚鼠發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分，說明α-MSH對EAE發(fā)病具有一定保護(hù)作用，通過進(jìn)一步測定Th1、Th2型相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)α-MSH能夠劑量依賴性地減少EAE豚鼠發(fā)病高峰期PBMC的IFN-γ分泌水平，增加分泌IL-4分泌，表明調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡可能是α-MSH發(fā)揮其免疫保護(hù)作用的靶點(diǎn)之一，即通過抑制Th1細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)Th2細(xì)胞的功能來達(dá)到防治EAE發(fā)生發(fā)展的作用。我們的結(jié)果也與Taylor[7]等的報(bào)道一致，即α-MSH可通過促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞極化方向的改變達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用。

目前尚無理想的藥物來阻止MS病情進(jìn)展，其它免疫治療藥物因費(fèi)用昂貴及毒副作用大等原因難以推廣，而α-MSH及其衍生物毒性低，副作用輕微，有良好的依從性，并且免疫調(diào)節(jié)作用強(qiáng)而廣泛，無明顯不良反應(yīng)[9-11]，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]Nakajima H， Fukuda K， Doi Y， et al. Expression of TH1/TH2-related chemokine receptors on peripheral T cells and correlation with clinical disease activity in patients with multiple sclerosis[J]. Eur Neurol， 2004， 52（3）：162-8

[2]Luger TA， Brzoska T. Alphα-MSH related peptides：a new class of anti-inflammatory and immunomodulating drugs[J]. Ann Rheum Dis，2007， 11（3）：52-55

[3]Brzoska T， Luger TA， Maaser C， et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone and related tripeptides：biochemistry， antiinflammatory and protective effects in vitro and in vivo， and future perspectives for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases[J]. Endocr Rev，2008，29（5）：581-602

[4]何維，高曉明，曹雪濤，等.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：16-17.

[5]趙武述.免疫平衡研究及其臨床意義[M].北京：科學(xué)出版社，2005：100-101.

[6]Kidd P. Thl/Th2 Balance： The Hypothesis， its limitations， and Implications for health and disease[J].Altern Med Rev，2003，8（3）：223-246.

[7]Taylor A， Namba K. In vitro induction of CD25+ CD4+ regulatory T cells by the neuropeptide alpha-melanocyte stimulating hormone （alpha-MSH） [J]. Immunol Cell Biol， 2001，79（4）：358-67.編輯/張燕