生物脫氫酶的制備、純化、活性檢測(cè)及在藥物篩選中的應(yīng)用

【摘要】脫氫酶（dehydrogenase是一類(lèi)催化物質(zhì)氧化還原反應(yīng)的酶，是已知酶中種類(lèi)最多的一類(lèi)，具有極其重要的生理學(xué)意義。本文介紹了其基本的相關(guān)概念，并對(duì)其制備、純化、活性檢測(cè)方法及在藥物篩選中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，以便為其進(jìn)一步研究提供參考。

【關(guān)鍵詞】脫氫酶：制備：純化：活性檢測(cè)：藥物篩選

doi：10.3969j.issn.1004-7484（x.2013.10.654文章編號(hào)：1004-7484（2013-10-6104-02

生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)稱(chēng)為新陳代謝，簡(jiǎn)稱(chēng)代謝。生命的特征之一是不斷地進(jìn)行新陳代謝，包括物質(zhì)代謝和能量代謝。雖然生物體內(nèi)的代謝條件十分溫和，但所有代謝都進(jìn)行得極為順利和迅速，因?yàn)樗鼈儙缀醵际窃谏锎呋瘎╞iocatalyst的催化作用下進(jìn)行的。迄今為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩類(lèi)生物催化劑：酶與核酶。酶（enzyme是由活細(xì)胞合成的、具有催化作用的蛋白質(zhì)。核酶（ribozyme是由活細(xì)胞合成的、具有催化作用的核酸。

根據(jù)酶促反應(yīng)的性質(zhì)可將酶分為六大類(lèi)：氧化還原酶類(lèi)、轉(zhuǎn)移酶類(lèi)、水解酶類(lèi)、裂解酶類(lèi)、異構(gòu)酶類(lèi)和合成酶類(lèi)。其中，氧化還原酶類(lèi)是催化氧化還原反應(yīng)的酶，又可分為氧化酶和脫氫酶兩類(lèi)。^[1]脫氫酶類(lèi)即需要輔酶Ⅰ（NA+或輔酶Ⅱ（NAP+作為受氫體，催化底物氫化脫氫反應(yīng)的酶。

AH2+NA（P+A+NA（PH+H+

脫氫酶（dehydrogenase是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類(lèi)代謝關(guān)鍵酶，在生物體內(nèi)的氧化產(chǎn)能、解毒等生理活動(dòng)中^[1]起重要作用，是已知酶中種類(lèi)最多的一類(lèi)。如糖代謝過(guò)程中的3-磷酸甘油醛脫氫酶、乳酸脫氫酶（糖酵解途徑^[2]，丙酮酸脫氫酶、二氫硫辛酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶（有氧氧化途徑，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（磷酸戊糖途徑等；脂肪代謝過(guò)程中的3-磷酸甘油脫氫酶、脂酰CoA脫氫酶、β-羥脂酰CoA脫氫酶、β-羥丁酸脫氫酶等；氨基酸代謝過(guò)程中的L-谷氨酸脫氫酶以及酒精代謝過(guò)程中的乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶等。^[1]目前，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)研究，本文將對(duì)其制備純化、活性檢測(cè)方法及在藥物篩選中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

1脫氫酶的制備純化

現(xiàn)在采用的純化方法都是以脫氫酶與雜蛋白在理化性質(zhì)和穩(wěn)定性上的差別以及脫氫酶的生物學(xué)特性為依據(jù)。^[3]①溶解度不同：有機(jī)溶劑沉淀法、鹽析法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法及雙水相分離法。②根據(jù)酶和底物、輔助因子以及抑制劑間具有專(zhuān)一親和作用特點(diǎn)的親和分離法等。③根據(jù)電學(xué)性質(zhì)、解離性質(zhì)：吸附層析法、離子交換層析法、電泳法及聚焦層析法等。④根據(jù)分子大小的差別：凝膠過(guò)濾層析法、超濾法及超離心法等。⑤按穩(wěn)定性不同：酸堿變性、法熱變性法、表面活性劑變性法等。通常先運(yùn)用非特異、低分辨率的操作單元，如沉淀、超濾和吸附等，這一階段的主要目的是盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，除去最主要的雜質(zhì)；然后是高分辨率的操作單元，如具有高效選擇性的離子交換色譜和親和層析，而將凝膠過(guò)濾層析這類(lèi)分離規(guī)模小、分離速度慢的單元放在最后。

武愛(ài)民等^[4]采用弱陰離子樹(shù)脂EAE-52和藍(lán)色瓊脂糖凝膠FF層析對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的胞外二氫硫辛酰胺脫氫酶的粗酶液進(jìn)行2步純化，得到電泳純的二氫硫辛酰胺脫氫酶，純化倍數(shù)為59.7，收率為46.9%。

夏玉鳳等^[5]以玉米黃化苗為生物材料，將其搗碎后，通過(guò)差速離心獲得線(xiàn)粒體，使用超聲波將其破碎，用2%TritonX-100溶膜，超速離心，硫酸銨沉淀，EAE-C32層析純化琥珀酸脫氫酶，純化倍數(shù)為12倍。電泳圖譜顯示一條帶。

李洪山等^[6]采用差速離心法、硫酸銨分級(jí)沉淀，EAE纖維素和半瓊脂糖柱層析方法，從早生植物梭梭體內(nèi)分離出純化104倍的蘋(píng)果酸脫氫酶。龔韌等^[7]以豬心肌為原料，采用組織破碎、二度硫酸銨鹽析、EAE Sepharose F.F.離子交換層析、Phenyl Sepharose 6F.F.疏水層析及Sephadex G-75 Fine凝膠過(guò)濾等方法進(jìn)行分離純化，蘋(píng)果酸脫氫酶比酶活達(dá)1212.97Umg，純化倍數(shù)達(dá)122.64倍，酶活力收率為53.64%。

asayoshi T^[8]等用含1%Triton X-100的緩沖液從F.saccharophilum的膜蛋白提取，先用陰離子交換柱EAE-Sephrose CL-6B和陽(yáng)離子交換柱C-Sephrose CL-6B分離，再用Sephacryl S-300凝膠過(guò)濾層析，得到了純化倍數(shù)為277的純葡萄糖3-脫氫酶，收率達(dá)到32%。

6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-PGAase在自然界中分布很廣，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已從植物、哺乳動(dòng)物肝臟等中純化出6-PGAase^[9]。莫宏春等^[10]將枯草芽孢桿菌通過(guò)超聲破壁，（NH42SO4分段鹽析，EAE-Sepharose FF離子交換層析，Blue-Sepharose CL-6B親和層析，Sephadex G-200凝膠過(guò)濾等純化步驟，分離出6-磷酸葡萄糖脫氫酶。

谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GH是生物體內(nèi)谷氨酸生物合成的一種重要酶，自20世紀(jì)60年代以來(lái)已經(jīng)有不同來(lái)源的GH得到分離純化和研究。^[11]朱鴻等^[12]以鴨肝為原料，采用丙酮脫脂、重金屬離子沉淀、硫酸銨分級(jí)沉淀、EAE-Sepharose離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠層析方法，分離純化得到谷氨酸脫氫酶。

乙醇脫氫酶（AH能夠催化乙醇氧化生成乙醛。.C.adhusudhan等^[13]采用硫酸銨及雙水相法共同沉淀蛋白質(zhì)來(lái)純化AH。N.A.Willoughby等^[14]采用膨脹床金屬親和層析來(lái)純化AH。Chuanul hidayat等^[15]使用染料—亞氨基二酸做配體，純化AH。

2脫氫酶的活性檢測(cè)

脫氫酶由活的生物體所產(chǎn)生，是一種氧化還原酶，在生物細(xì)胞內(nèi)催化有機(jī)物氧化脫氫，并將其傳遞給最終受氫體。它能夠催化氫從被氧化的物體（基質(zhì)AH上轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物體（受氫體B上：AH+B→A+BH，即酶促有機(jī)物質(zhì)脫氫的作用。因此，脫氫酶活性可以通過(guò)加入人工受氫體，采用分光光度法、熒光法、同位素法和電化學(xué)法等測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)。

通常用于檢測(cè)脫氫酶活性的人工受氫體包括TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑^[16]、刃天青^[17]以及INT（碘硝基四唑紫^[18]等，其中研究和應(yīng)用最廣的是TTC。

姚莉麗等^[19]采用可見(jiàn)分光光度法（利用2，4-二硝基苯肼和丙酮酸作用，生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕色，最大吸收波長(zhǎng)為520nm檢測(cè)了乳酸脫氫酶的活性。

陳立華等^[20]采用紫外分光光度法測(cè)定了紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性。紫外分光光度法測(cè)定G-6-P酶活性，采用測(cè)定NAPH生成量的吸光度變化量來(lái)反映酶活性高低，是一種酶活性的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)方法，故可對(duì)G-6-P活性定量測(cè)定。

曹偉峰等^[21]用定量熒光法檢測(cè)新生兒篩查濾紙干血斑標(biāo)本葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6P活性。

陳麗麗等^[22]應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出了納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因，構(gòu)建表達(dá)載體對(duì)其進(jìn)行體外表達(dá)，并采用分光光度法對(duì)表達(dá)的蛋白谷氨酸脫氫酶酶活性進(jìn)行了分析。

3脫氫酶在藥物篩選中的應(yīng)用

在當(dāng)代藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)和選擇合適的藥物靶點(diǎn)是藥物開(kāi)的第一步，也是藥物篩選及藥物定向合成的關(guān)鍵因素之一。^[23]而酶是一類(lèi)重要的藥物靶點(diǎn)。

隨著細(xì)胞及分子生物學(xué)的發(fā)展，新技術(shù)方法越來(lái)越多地用于新靶點(diǎn)建立和藥物篩選研究，高通量篩選是20世紀(jì)80年代后期形成的尋找新藥的高新技術(shù)，是以藥物作用靶點(diǎn)為主要對(duì)象的細(xì)胞和分子水平的篩選模型，作為一種高度集成化的分析方式，芯片技術(shù)在藥物的高通量篩選中具有巨大的優(yōu)勢(shì)，如酶芯片，其理論基礎(chǔ)之一便是對(duì)酶活性的影響，如在以酶抑制劑為篩選目標(biāo)篩選時(shí)，可采用酶活性作為指標(biāo)，說(shuō)明藥物的作用，^[24]可將酶芯片應(yīng)用于酶抑制作用的篩選。

脫氫酶作為種類(lèi)最多的一類(lèi)代謝關(guān)鍵酶，雖然其在藥物篩選方面仍處于起步階段，但隨著各種脫氫酶與疾病密切關(guān)系的闡明，在不遠(yuǎn)的未來(lái)，其一定會(huì)成為藥物發(fā)現(xiàn)中的重要武器。

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