雄激素受體敲除小鼠睪丸生精功能變化及p63的表達

[摘要] 目的 研究雄激素受體（AR）敲除小鼠睪丸生精功能及p63在曲細精管中表達的改變。 方法 采用雄性Flox-AR小鼠與雌性ACTB-Cre小鼠交配，并敲除胚胎中AR，篩選AR敲除（AR敲除組）和AR未敲除（對照組）雄性小鼠各10只，對比睪丸曲細精管生精功能及p63的表達。 結果 兩組小鼠曲細精管內徑、管周膜厚度、管壁生殖細胞層數、生殖細胞成熟度評分及總Makler評分之間差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），p63的陽性表達主要位于精原細胞及精母細胞，精子細胞及成熟精子中表達呈陰性，且AR敲除組表達陽性率及HSCRE評分均顯著低于對照組（P < 0.01）。 結論 AR表達與小鼠睪丸曲細精管p63表達關系密切，AR敲除小鼠睪丸曲細精管生精功能受損、p63表達下調，p63調控生殖細胞的早期分化。

[關鍵詞] 雄激素受體；基因；p63；生精功能

[中圖分類號] R698.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）34-0001-03

The testicular spermatogenic function and expression of p63 in androgen receptor knockout mouse

ZHENG Chunwei CHEN Yu FENG Yibo HUANG Qiang

Laboratory Animal Center of Zhejiang Province Traditional Chinese Medicine Academy， Hangzhou 310007， China

[Abstract] Objective To study spermatogenesis and p63 expression in the seminiferous tubules of the testicular androgen receptor （AR） knockout mice. Methods Male Flox-AR mice mated with female ACTB-Cre mice， and knocked the AR in addition to embryos， screening AR knockout male mice （ARKO group） and AR did not knock （control group），each of 10 mice. Contrasted testis seminiferous tube spermatogenic function and p63 expression. Results The differences of seminiferous tube diameter， the peritubular film thickness， wall germ cell layers， the germ cell maturity score and Makler score between two groups were statistically significant （P < 0.05）， p63 mainly expressed in spermatogonia and spermatocytes， expressed in sperm cells and mature sperm were negative， and AR knockout group expression the positive rate and HSCRE of scores were significantly lower than the control group （P < 0.01）. Conclusion AR expression in mouse testis seminiferous tubules are closely related p63 expression. AR knock damage in addition to the mouse testis seminiferous tube spermatogenic function of p63 downregulation of p63 regulation of the early differentiation of the germ cells.

[Key words] Androgen receptor； Gene； p63； Spermatogenic function

雄激素主要由睪丸間質細胞分泌，誘導男性性別的分化，促進內生殖器發(fā)育，進入曲細精管促進生精細胞的分化和精子生成[1]。雄激素受體（androgen receptor，AR）主要分布于睪丸內支持細胞、間質細胞、管周細胞、血管平滑肌細胞及內皮細胞等組織，與雄激素結合調節(jié)靶基因表達，介導雄激素發(fā)揮一系列的生物學作用，對性別分化、男性性成熟及精子生成有重要作用，AR突變導致與雄激素結合力或受體轉錄后的活性發(fā)生改變，從而影響男性生育能力[2]。有研究表明，AR缺陷的小鼠可能出現睪丸顯著縮小，前列腺、附睪、精囊等組織的缺如，血清睪酮水平降低[3]。其作用的途徑和方式的研究對了解男性生殖系統(tǒng)發(fā)育有十分重要的意義。p63與抑癌基因p53同源，在不同的組織和不同發(fā)育階段具有不同的生物學功能。p63在胚胎的外胚層和表皮組織基底層和生發(fā)層中顯著表達，通過其編碼的活性產物調節(jié)胚胎形成期外胚層的分化，在哺乳動物胚胎發(fā)育階段，調控各種上皮組織的正常發(fā)生和分化，并維持細胞的形態(tài)，是胚胎發(fā)育過程中上皮分層所必需的蛋白質[4，5]。p63缺陷小鼠皮膚及泌尿生殖道上皮出現發(fā)育不全[6]。本研究于2012年1～12月進行AR敲除小鼠睪丸生精功能及p63在曲細精管的表達研究，旨在探討AR敲除對小鼠生殖功能及睪丸發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性Flox-AR小鼠，由美國羅切斯特大學醫(yī)學中心張傳祥教授實驗室提供[6]；雌性ACTB-Cre小鼠，由美國JAX實驗室提供。小鼠抗人p63單克隆抗體、S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.2 方法

按Flox-AR小鼠與ACTB-Cre小鼠交配。采用Cre-lox法[7]敲除胚胎中小鼠AR。取子代小鼠尾巴組織標本，通過PCR檢測基因型，選擇AR敲除的雄性小鼠10只作為AR敲除組，AR未敲除雄性小鼠10只作為對照組。至10周齡稱重后以5%CO處死，均取右側睪丸，4%中性甲醛液固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切4 μm薄片，脫蠟，水化，采用p63鼠單克隆抗體以S-P免疫組織化學染色法進行組織p63染色，操作均按試劑盒說明進行。DAB顯色，沖洗，蘇木精復染，以PBS代替一抗作陰性對照。置于高倍光學顯微鏡下觀察，p63主要定位于細胞核，細胞核呈棕黃色則為p63陽性。隨機選取視野內10個睪丸曲細精管斷面，觀察p63表達，測定曲細精管內徑、管壁生殖細胞層數目、管周膜厚度、生殖細胞成熟度。

1.3 判斷標準

睪丸生精功能采用Makler評分法[8]測定，曲細精管內徑、管壁生殖細胞層數目、管周膜厚度、生殖細胞成熟度，每項分為0～5分，滿分20分，得分越高功能越正常。p63表達強度采用半定量的免疫組織化學積分法（HSCORE）[5]，公式：HSCORE=∑Pi（i+1）。染色強度的主觀評估（i）由無染色至強染色分為0～3分，Pi為每個細胞中的強度百分比。

1.4 統(tǒng)計學處理

數據采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，相關性采用Spearman等級相關分析，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組睪丸生精功能比較

兩組小鼠曲細精管內徑、管周膜厚度、管壁生殖細胞層數、生殖細胞成熟度評分及總Makler評分之間差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），AR敲除組睪丸生精功能顯著低于對照組，見表1。

表1 兩組睪丸生精功能及p63表達的比較（x±s）

2.2 p63在小鼠睪丸曲細精管中的表達

p63的陽性表達主要位于精原細胞及精母細胞，精子細胞及成熟精子中表達呈陰性，且AR敲除組表達陽性率及HSCRE評分均顯著低于對照組（P < 0.01），見表1；AR敲除組p63表達強度顯著低于對照組，見圖1、2。經Spearman等級相關分析，p63的表達強度與Makler評分呈正相關（r=0.88，P < 0.01）。

3 討論

AR存在于睪丸的支持細胞、間質細胞、管周細胞、血管平滑肌細胞及內皮細胞內介導睪丸結構及功能的發(fā)育，而支持細胞、間質細胞、管周細胞等的發(fā)育依賴雄激素及AR的表達，AR表達缺陷則可能造成睪丸各組織結構發(fā)育不全。本研究采用雄性Flox-AR小鼠與雌性ACTB-Cre小鼠交配，從而使子代雄性小鼠所有細胞表達Cre，并能通過Cre-lox法敲除胚胎中的AR，建立AR敲除的小鼠模型，經PCR檢測基因型確認模型成功建立。取AR敲除組小鼠睪丸組織樣本鏡檢結果顯示，小鼠的曲細精管內徑、管周膜厚度、管壁生殖細胞層數、生殖細胞成熟度與未敲除AR的對照組相比，存在顯著差異。AR表達缺陷的小鼠曲細精管內徑變細，管周膜厚度增加，管壁生殖細胞層數減少，生殖細胞成熟度低。通過Makler評分法評估，其睪丸生精功能顯著低于對照組，由于AR的表達在生精周期第Ⅱ～Ⅶ期表達逐漸增強，第Ⅷ期后減弱，而在Ⅺ期出現特異性表達，表明其表達強弱與生精周期密切相關，參與精子生成的調控[9，10]，因此AR缺陷使小鼠曲細精管及生精細胞的結構及功能發(fā)育出現顯著異常，生精周期出現功能紊亂影響雄性小鼠的精子生成。

p63缺失的小鼠可能出現頭頸部表皮和肢端的發(fā)育畸形，前列腺、乳腺及尿道上皮的發(fā)育缺陷[11，12]。本研究對小鼠曲細精管中的p63表達進行分析，在小鼠曲細精管組織中p63表達主要位于精原細胞及精母細胞細胞核，呈棕黃色顆粒，AR表達正常的對照組小鼠曲細精管組織中p63表達強度很高，p63陽性細胞為（82.73±5.44）%，而AR敲除組p63陽性率僅為（67.38±2.93）%，半定量的HSCORE評分亦顯示AR敲除組表達強度顯著低于對照組，說明在胚胎期敲除AR導致小鼠生殖系統(tǒng)上皮及腺體內p63的表達降低。并且p63的表達與Makler評分呈正相關，說明p63低表達與曲細精管的生精能力下降有關。AR敲除組小鼠曲細精管細胞的分化存在顯著的缺陷，導致生殖細胞的成熟障礙，而p63表達強度弱，提示AR缺陷不僅使雄激素作用減弱，靶細胞和組織發(fā)育缺陷，AR可能對p63在曲細精管中的表達有調控作用，甚至同時對多種睪丸組織結構的p63產生影響而導致發(fā)育缺陷，仍有待進一步研究。由此可推測p63可能使AR介導雄性生殖器發(fā)育的途徑之一，AR被敲除的情況，p63表達下調可能是造成阻礙曲細精管生精上皮發(fā)育缺陷的直接作用因素，由于p63的染色主要位于精原細胞和精母細胞，而精子細胞及成熟精子中未見陽性[13-15]，因此提示敲除AR導致的p63缺陷對小鼠曲細精管生精上皮的發(fā)育的影響主要集中在早期分化階段。

綜上所述，AR敲除小鼠睪丸曲細精管組織結構發(fā)育障礙，生精上皮的生精功能缺損。AR缺陷下調了p63在曲細精管生精上皮中的表達，從而使生精上皮分化障礙，導致精子早期分化階段發(fā)育缺陷影響雄性小鼠的生育能力。

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（收稿日期：2013-05-31）