姜黃素增強宮頸癌放療療效的實驗研究

【中圖分類號】R97 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1672-3783（2013）12-0188-01

【摘要】目的 觀察姜黃素對宮頸癌Hela細(xì)胞的放射增敏作用。方法 MTT法檢測姜黃素和放射線對Hela細(xì)胞的抑制作用，繪制細(xì)胞抑制率曲線，研究姜黃素與放射聯(lián)合應(yīng)用時的作用特點；流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果 姜黃素對Hela細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈時間和濃度依賴性；單純照射對宮頸癌增殖有平臺效應(yīng)， 聯(lián)用姜黃素則可進一步增強對宮頸癌的殺傷效應(yīng)；單獨照射和姜黃素均能使細(xì)胞周期阻滯于放射敏感時相G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，聯(lián)合作用效果更加顯著。結(jié)論 姜黃素可通過阻滯細(xì)胞周期于G2/M期對宮頸癌Hela細(xì)胞產(chǎn)生放療增敏作用。

放射治療是宮頸癌的重要治療手段，對宮頸癌的照射不可避免的會對宮頸周圍膀胱、直腸等器官造成輻射損傷 [1]。故而，采用同步放化療綜合治療模式，即通過同步應(yīng)用小劑量化療藥物在不增加甚至降低射線劑量的基礎(chǔ)上達(dá)到增強放射線對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用已被廣泛應(yīng)用于臨床多種腫瘤的治療[2]。

姜黃素具有多種藥理活性。有研究表明姜黃素對胰腺癌[3]、腎癌[4]、前列腺癌[5]具有放療增敏作用，但對宮頸癌放療作用報道較少，本文通對此進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌Hela細(xì)胞株（湖北醫(yī)藥學(xué)院臨床研究所）；姜黃素（HPLC>98%，成都思科華生物技術(shù)有限公司）；Clinac 600C/D加速器（ 美國Varian 公司）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coluter公司）。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的1640中，并置于含5%C02的37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2照射方法 在室溫下采用6MV-X線照射，照射野10×10cm，劑量率40 cGy/min，源皮距為100cm，分別一次性給予各實驗組6、8、10、12、14、16Gy劑量。

1.2.3放射線對Hela細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期Hela細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，參照文獻按輻射劑量分為6、8、10、12、14、16Gy共6組，每組設(shè)5個復(fù)孔，給予一次性射線照射12、24、48h后，每孔加入20μL MTT（5g/L），繼續(xù)孵育4h，棄各孔液體，每孔加入150μL二甲基砜，低速震蕩10min，酶標(biāo)儀檢測各孔在562nm波長處吸光度值，計算抑制率，求出輻射劑量坪值，即細(xì)胞增殖抑制率達(dá)最高的射線劑量。細(xì)胞抑制率=（1-實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值） ×100%。

1.2.4MTT法測定姜黃素的輻射敏感性 取對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，分為空白組、單藥組、單放組、藥放組?？瞻捉M只加細(xì)胞與培養(yǎng)液；單放組劑量取上述實驗的坪值；單藥組姜黃素終濃度參照文獻確定為50，25，12.5，6.25，3.125μmol/L共5組，藥放組輻射劑量和藥物濃度分別同單放組劑量和單藥組濃度，共5組，每組設(shè)5個平行樣本，測定各組吸光值后通過公式計算細(xì)胞抑制率。

1.2.5細(xì)胞周期分析及凋亡檢測 細(xì)胞分組及處理同1.2.4，取處理完畢的4組細(xì)胞各1×106個， PBS洗2次，加入70%冷乙醇4℃固定過夜，清除固定液，加入PBS100μl混勻細(xì)胞，再加入10g/LRNAase2μl充分混勻，置37℃水浴鍋中加溫30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常溫避光30min后，流式細(xì)胞儀檢測，Multicycle軟件分析，擬合計算出細(xì)胞各時相百分比和凋亡率。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示，SPSS17.0軟件模擬生存曲線并進行單因素方差分析（兩兩比較采用S-N-K法），以P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義，以P<0.01為差別有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hela細(xì)胞對射線照射的敏感性 射線照射對宮頸癌細(xì)胞增殖可產(chǎn)生明顯的抑制作用，在射線劑量12Gy以內(nèi)時，隨著射線劑量的加大和照射后作用時間的延長，對細(xì)胞增殖的抑制率也明顯增加，呈現(xiàn)出一定的量效和時效關(guān)系。在12Gy處出現(xiàn)坪值，故選用12Gy加藥物進行后續(xù)的增敏實驗。

2.2姜黃素對Hela細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)不同濃度姜黃素作用24、48、72h后，Hela細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制，并呈時間，濃度依賴性。各濃度姜黃素作用48h，細(xì)胞增殖抑制率在7%-81%之間，與對照組比較，12.5μmol/L姜黃素即可產(chǎn)生有統(tǒng)計學(xué)差異的抑制作用（P<0.05），而25μmol/L及以上濃度的姜黃素抑制作用則更強（P<0.01）。

2.3姜黃素對Hela細(xì)胞的放射增敏作用 選取12Gy劑量射線加不同濃度姜黃素作用于Hela細(xì)胞結(jié)果顯示出細(xì)胞增殖抑制率可進一步隨藥物濃度的增加而升高，當(dāng)濃度大于25μmol/L時曲線趨于平坦。藥物加輻射后，其24h細(xì)胞增殖抑制率均較單純輻射或單純藥物組有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

2.4細(xì)胞周期分析及凋亡檢測 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡結(jié)果表明，與空白組比較，單純放射或藥物均能提高G2/M期細(xì)胞比例，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡（P<0.05），而放射與藥物聯(lián)合則作用效果更為顯著（P<0.01）。

3討論

姜黃素具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗血管新生以及抗腫瘤等多種生物學(xué)功能。本研究中，筆者觀察了姜黃素同步放療對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純應(yīng)用姜黃素，細(xì)胞增殖抑制率與藥物濃度的增加成正比；單純應(yīng)用放射線照射，細(xì)胞抑制率也隨射線劑量的增加而增加，但當(dāng)輻射劑量達(dá)到12Gy時細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到坪臺期，不再隨射線劑量的加大而增加。在此基礎(chǔ)上，選用12Gy放射線聯(lián)合不同濃度的姜黃素做進一步的觀察，結(jié)果顯示，在單純輻射劑量已達(dá)到“閾值”的情況下，聯(lián)用姜黃素可使細(xì)胞增殖抑制效果得到進一步的提高，且對細(xì)胞增殖的抑制率高于單純放射組和單純藥物組（P<0.05），說明同步應(yīng)用姜黃素確實可對宮頸癌細(xì)胞放療產(chǎn)生增效的作用，但這種增效作用只是控制在一定濃度的范圍之內(nèi)。

為初步探明增效機制，筆者進一步檢測了姜黃素同步放療后對宮頸癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨藥物、單獨射線均能對細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡和G2/M期阻滯的作用，而聯(lián)合應(yīng)用后作用效果更為顯著，這說明姜黃素的放療增敏作用與其能阻滯細(xì)胞周期于對放療敏感時相G2/M期有關(guān)。△湖北省十堰市科技局基金資助項目（ZD2012026） 湖北醫(yī)藥學(xué)院第三臨床學(xué)院資助項目（201201）

參考文獻

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[2]徐鳳華，郭榮榮，孫華燕.吉非替尼治療晚期非小細(xì)胞肺癌的系統(tǒng)評價[J].中國循證醫(yī)學(xué)雜志，2009，9（2）：218-229.

[3]Veeraraghavan J，Natarajan M，Lagisetty P，etl.Impact of curcumin， raspberry extract， and neem leaf extract on rel protein-regulated celldeath/radiosensitizationin pancreatic cancer cells[J].Pancreas.2011，40（7）：1107-1119.

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[5]LiM，Zhang Z，Hill DL，etl.Curcumin，a dietary component，has anticancer， chemosensitization，and radiosensitization effects by down-regulating the MDM2 oncogene through the PI3K/mTOR/ETS2 pathway[J].Cancer Res.2007，67（5）：1988-1996.