miR—34a對人成骨肉瘤MG—63細胞生長增殖的影響

[摘要] 目的 探討miR-34a對人成骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響。 方法 運用miR-34a的mimics或inhibitors分別轉(zhuǎn)染人成骨肉瘤MG-63細胞，分別為實驗組，脂質(zhì)體2000為對照組，采用甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測細胞增殖情況。 結(jié)果 對照組吸光度值在24 h、48 h和72 h分別為（0.33±0.02）、（0.55±0.03）、（0.75±0.06）；miR-34a mimics可抑制MG-63細胞增殖，其吸光度值分別降至（0.21±0.02）、（0.26±0.03）、（0.31±0.04），經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；miR-34a inhibitors可使人成骨肉瘤MG-63細胞的增殖活性增強，其吸光度值分別增加到（0.41±0.05）、（0.71±0.08）、（0.94±0.08），經(jīng)統(tǒng)計學分析差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 結(jié)論 miR-34a可使人成骨肉瘤細胞的增殖活性下調(diào)，其在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮一個抑瘤基因的作用。

[關(guān)鍵詞] miR-34a；人骨肉瘤；細胞生長

[中圖分類號] R738.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）21-0023-02

眾所周知，miRNA成為分子生物學研究熱點，人類miRNA充當癌基因或抑癌基因的作用調(diào)控其靶基因的表達及相關(guān)信號通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用[1，2]。miRNA參與個體發(fā)育、造血、脂肪代謝、器官生成以及細胞的增殖、分化、凋亡等活動，絕大多數(shù)癌基因或抑癌基因受到miRNAs分子的調(diào)控[3-6]。本文采用MTT技術(shù)探討miR-34a在骨肉瘤中生物學功能和分子機制，為進一步闡明成骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 人成骨肉瘤MG-63細胞購自上海細胞生物學研究所。

1.1.2 試劑 MTT為Sigma產(chǎn)品，購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；miR-34a mimics與inhibitors購自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體Lipo2000購自Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MG-63細胞用DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT比色法 為檢測miR-34a對MG-63細胞生長增殖的影響，設(shè)計好實驗組與對照組，每組設(shè)計重復孔3個，分別在轉(zhuǎn)染各時間點后每孔加入配置好的MTT溶液20 μL，37℃培養(yǎng)4 h后倒掉培養(yǎng)基，每孔加150 μL二甲亞砜，靜置或輕搖10 min，然后檢測各孔的吸光度值。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 消化傳代待細胞增長到70%～80%左右。準備好2.5 μL的脂質(zhì)體Lipo2000與100 μL無血清MEM培養(yǎng)基充分混勻，然后靜置15～20 min，分別用PBS與無血清MEM培養(yǎng)基洗滌細胞；一起加入96孔板中，然后按說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均由SPSS 13.0軟件進行處理，兩組間比較采用t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-34a inhibitors對人成骨肉瘤細胞MG-63生長增殖的影響

人成骨肉瘤MG-63細胞經(jīng)miR-34a inhibitors處理后，細胞生長明顯比未處理細胞的生長迅速；處理1 d、2 d、3 d后經(jīng)MTT檢測其吸光值，對照組分別為（0.33±0.02）、（0.55±0.03）、（0.75±0.06），處理組分別為（0.41±0.05）、（0.71±0.08）、（0.94±0.08），miR-34a inhibitors處理后均顯著上調(diào)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=12.38，P < 0.01）。提示干擾miR-34a可促進人成骨肉瘤細胞MG-63生長增殖的作用。

2.2 miR-34a mimics對人成骨肉瘤細胞MG-63生長增殖的影響

MG-63細胞經(jīng)miR-34a mimics處理后，MG-63細胞生長明顯比未處理細胞的生長減緩；處理1 d、2 d、3 d后經(jīng)MTT檢測其吸光值，對照組分別為（0.33±0.02）、（0.55±0.03）、（0.75±0.06），處理組分別為（0.21±0.02）、（0.26±0.03）、（0.31±0.04），處理后均顯著下調(diào)，二組比較差異有統(tǒng)計學意義（t = 9.69，P < 0.01）。提示過表達miR-34a可抑制人成骨肉瘤細胞MG-63生長增殖的作用。

3 討論

骨肉瘤是最常見的惡性骨原發(fā)腫瘤，發(fā)病率約為1/1 000 000～1/100 000，絕大部分的骨肉瘤好發(fā)于10～30歲[7]。近年來，隨著影像學的進步，保肢手術(shù)、新輔助化療、肺轉(zhuǎn)移瘤清掃術(shù)的綜合應用，骨肉瘤的臨床預后得到了較大的改善[8]。但我們對骨肉瘤生物學功能及發(fā)病機制的掌握十分有限，缺乏針對骨肉瘤的特異性治療措施。尤其骨肉瘤的轉(zhuǎn)移機制不清楚。因此，深入研究骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

目前miR-34a在腫瘤中研究如火如荼，是一個“明星miRNA分子”。研究顯示，miR-34a在結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤組織和細胞中表達下調(diào)，且過表達miR-34a抑制多種腫瘤的生長、侵襲與轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用[9-12]。本研究顯示miR-34a的mimics及inhibitors分別可抑制和促進人成骨肉瘤MG-63細胞生長增殖活性，提示miR-34a可能作為抑癌基因miRNA參與成骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。同其他腫瘤一樣，骨肉瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移是一個復雜的生物學問題，是多基因、多因素、環(huán)境與遺傳因素相互作用的結(jié)果。惡性腫瘤一個重要的生物學特征是其對周圍組織的侵襲和破壞，并在遠隔器官形成轉(zhuǎn)移灶，腫瘤細胞發(fā)展到一定階段，便向周圍傳播，侵蝕正常組織，這種細胞浸潤能力的獲得是腫瘤細胞變成惡性過程中的一個重要環(huán)節(jié)。miR-34a有調(diào)控骨肉瘤細胞的增殖能力，利用miRNA可能成為基因治療骨肉瘤的一個新的研究方向。將有利于闡明miR-34a在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶標和診斷的生物標志物，有望為骨肉瘤的臨床診斷和治療提供新的策略和方法。

[參考文獻]

[1] Tang H，Liu X，Wang Z，et al. Interaction of hsa-miR-381 and glioma suppressor LRRC4 is involved in glioma growth[J]. Brain Res，2011，1390（1）：21-32.

[2] Saini S，Yamamura S，Majid S，et al. MicroRNA-708 induces apoptosis and suppresses tumorigenicity in renal cancer cells[J]. Cancer Res，2011，71（2）：6208-6219.

[3] Srivastava SK，Bhardwaj A，Singh S，et al. MicroRNA-150 directly targets MUC4 and suppresses growth and malignant behavior of pancreatic cancer cells[J]. Carcinogenesis，2011，32（18）：1832-1839.

[4] Ma L，Teruya-Feldstein J，Weinberg RA. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer[J]. Nature，2007，449（7163）：682-688.

[5] Negrini M，Calin GA. Breast cancer metastasis： a microRNA story[J]. Breast Cancer Res，2008，10（2）：203.

[6] Zhu S，Wu H，Wu F，et al. MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis[J]. Cell Res，2008，18（3）：350-359.

[7] Meyers PA，Schwartz CL，Krailo MD，et al. Osteosarcoma： the addition of muramyl tripeptide to chemotherapy improves overall survival-a report from the Children’s Oncology Group[J]. J Clin Oncol，2008，26（4）：633-638.

[8] Meyers PA，Schwartz CL，Krailo MD，et al. Osteosarcoma： a randomized， prospective trial of the addition of ifosfamide and/or muramyl tripeptide to cisplatin， doxorubicin， and high-dose methotrexate[J]. J Clin Oncol，2005，23（9）：2004-2011.

[9] Wu J，Wu G，Lv L，et al. MicroRNA-34a inhibits migration and invasion of colon cancer cells via targeting to Fra-1[J]. Carcinogenesis，2012，33（3）：519-528.

[10] Liu C，Kelnar K，Liu B，et al. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44[J]. Nat Med，2011，17（2）：211-215.

[11] Yang P，Li QJ，F(xiàn)eng Y，et al. TGF-β-miR-34a-CCL22 signaling-induced Treg cell recruitment promotes venous metastases of HBV-positive？hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Cell，2012，22（3）：291-303.

[12] Guessous F，Zhang Y，Kofman A，et al. microRNA-34a is tumor suppressive in brain tumors and glioma stem cells[J]. Cell Cycle，2010，9（6）：1031-1036.

（收稿日期：2013-04-23）