DcR3和CD105標(biāo)記的MVD在宮頸癌中的表達(dá)及意義

[摘要] 目的 觀察不同宮頸病變組織中DcR3 蛋白和CD105 標(biāo)記的微血管密度（MVD）的表達(dá)情況，進(jìn)而探討二者間的相互關(guān)系。 方法 采用SP免疫組化法檢測(cè)42 例宮頸癌、24例宮頸上皮內(nèi)瘤變和18例宮頸正常組織中DcR3 蛋白的表達(dá)情況，并進(jìn)行CD105 標(biāo)記的MVD 計(jì)數(shù)。 結(jié)果 宮頸癌組織中DcR3 陽(yáng)性表達(dá)率為85.71%，遠(yuǎn)高于正常宮頸組和CIN組，三組間經(jīng)Bonferroni法兩兩比較后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。DcR3 表達(dá)陽(yáng)性的宮頸癌組織中MVD 亦高于陰性組織（P < 0.05） ，經(jīng)Spearman 秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)二者存在線性正相關(guān)關(guān)系（r = 0.42，P < 0.05）。 結(jié)論 DcR3的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤血管的生成和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其可作為臨床宮頸癌診斷、治療及判斷預(yù)后的新指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌；誘導(dǎo)受體3；微血管密度；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）26-0032-03

宮頸癌為常見(jiàn)的婦科腫瘤，其發(fā)病率及死亡率僅次于乳腺癌，而且，近10年來(lái)，宮頸癌發(fā)生有明顯上升和年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重影響女性身心健康[1]。為此早期診斷及早期治療是關(guān)鍵。已有研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌血管的生成對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移非常重要，那么影響宮頸癌血管生成及抑制的各項(xiàng)研究則成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。誘導(dǎo)受體3（decoy receptor 3，DcR3）作為腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族的新成員，是一種特殊的細(xì)胞凋亡抑制劑，其與腫瘤壞死因子樣配體1A（TL1A）結(jié)合通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)新生血管的形成[2]。而CD105 作為血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，在內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)，參與了新生血管的生成過(guò)程[3]。本文通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)不同宮頸病變組織中DcR3 蛋白和CD105 標(biāo)記的微血管密度（MVD）的表達(dá)情況，進(jìn)而探討二者間的相關(guān)性，為臨床宮頸癌的診斷、治療及預(yù)后判斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

于2011年2月～2013 年4月隨機(jī)收集在我院婦產(chǎn)科門診行宮頸癌根治術(shù)或活檢的病理標(biāo)本84例，其中42例確診為宮頸癌組織，平均年齡（42.7±5.8）歲（32～67歲），18例未絕經(jīng)，24例已絕經(jīng)；宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）組織24例，平均年齡（37.0±7.2）歲（27～55 歲），13例未絕經(jīng)，11例已絕經(jīng)。同時(shí)選擇我院同期因子宮肌瘤行子宮全切，且術(shù)后病理證實(shí)為慢性宮頸炎組織18例作為對(duì)照組，平均年齡（34.21±7.3）歲（29～50 歲），8例未絕經(jīng)，10例已絕經(jīng)。所有標(biāo)本由我院病理科協(xié)助診斷，且有確切隨訪資料，各組患者術(shù)前均未行放化療，半年內(nèi)未經(jīng)過(guò)激素治療。宮頸癌患者的臨床分期則按照FIGO 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期分別為16、22和4例，其中手術(shù)32例：Ⅰ期12例，ⅡA期8例，ⅡB期12例，經(jīng)術(shù)后病理確診有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者10例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22例；組織學(xué)類型腺癌8例，鱗癌34例。

1.2 試劑來(lái)源

鼠抗人CD105 單克隆抗體（即用型，福州邁新生物公司）；鼠抗人DcR3 單克隆抗體（捷克BioVendorLaboratory Medicine 公司）；SP 免疫組化試劑盒和DAB染色試劑盒（北京中衫金橋生物公司）。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1 SP染色測(cè)定 DcR3和CD105的檢測(cè)均采用SP染色技術(shù)，陽(yáng)性對(duì)照為已知的陽(yáng)性標(biāo)本，空白對(duì)照為PBS緩沖液。實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體步驟如下：①取經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的標(biāo)本，連續(xù)切片；②常規(guī)脫蠟水化；③用3%H2O2-甲醇液滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；④組織抗原沸水浴修復(fù)15 min，自然冷卻至室溫；⑤滴加10%正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，甩去多余的液體；⑥滴加一抗，37℃室溫下復(fù)溫45 min后4℃過(guò)夜；⑦滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫靜置1 h；⑧滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶，室溫下孵育1 h；⑨DAB 顯色5 min（顯微鏡下掌握染色程度），自來(lái)水沖洗10 min終止反應(yīng)；⑩蘇木精復(fù)染2 min，自來(lái)水沖洗10 min；常規(guī)脫水、透明、封片，鏡檢并拍照（所有步驟之間均用PBS沖洗2～3次，每次5 min）。

1.3.2 結(jié)果判定 （1）DcR3表達(dá)結(jié)果判定：DcR3蛋白的表達(dá)主要在細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核和（或）胞質(zhì)內(nèi)有棕色或棕褐色顆粒即為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)具有代表性的高倍野，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。采用Gatalica等[5]的半定量方法，分別對(duì)染色強(qiáng)度（無(wú)特異性染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分）和陽(yáng)性細(xì)胞百分率（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～75%為2分，>75%為3分）進(jìn)行計(jì)分；每張切片以兩種計(jì)分相乘的結(jié)果作為免疫組化評(píng)分：陰性（-），0分；弱陽(yáng)性（+），2～3分；中等陽(yáng)性（++），4～6分；為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），>6分。所有切片均由我院兩位資深病理醫(yī)師用雙盲法對(duì)其進(jìn)行評(píng)分。（2）CD105 標(biāo)記的MVD表達(dá)結(jié)果判定：CD105 表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜及胞漿中，任何被染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，與鄰近周圍腫瘤細(xì)胞和結(jié)締組織成分結(jié)構(gòu)不相連的部分，即可作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)。參考Weidner 等[6]MVD計(jì)數(shù)方法并加以改進(jìn)：先在100×顯微鏡下找到腫瘤組織中MVD 密度最高的區(qū)域，然后選擇3個(gè)血管分布均勻的區(qū)域，在400×顯微鏡下計(jì)數(shù)染成棕黃色的微血管數(shù)，其中染色模糊不清的不計(jì)入計(jì)數(shù)結(jié)果。同一切片分別由我院兩位資深病理醫(yī)師采用雙盲法計(jì)數(shù)微血管數(shù)目，取計(jì)數(shù)中較高的數(shù)據(jù)作為該切片的MVD 結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)。P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同宮頸組織中DcR3的表達(dá)情況

見(jiàn)封三圖1。 從圖1中可以看出，DcR3在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸癌組織中均有不同程度表達(dá)。其中正常宮頸組織僅表達(dá)少量的DcR3，而宮頸癌組DcR3的表達(dá)量則較多，其表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)85.71%，遠(yuǎn)高于正常宮頸組和CIN組，三組間經(jīng)Bonferroni法兩兩比較后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）（表1）。

2.2 不同宮頸組織中CD105標(biāo)記的MVD的表達(dá)情況

三組間CD105標(biāo)記的MVD的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），進(jìn)一步采用Bonferroni法兩兩比較后，在α=0.016檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，正常宮頸組與宮頸癌組、正常宮頸組與CIN組以及CIN組與宮頸癌組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）（表2）。

2.3 宮頸癌組織中DcR3 蛋白和CD105 表達(dá)的相關(guān)性

選取宮頸癌中DcR3蛋白表達(dá)陽(yáng)性的切片計(jì)數(shù)其CD105 標(biāo)記的MVD值為（27.54±9.47），而DcR3蛋白表達(dá)陰性的宮頸癌切片其MVD值為（7.38±3.04），可見(jiàn)，宮頸癌中DcR3 蛋白表達(dá)陽(yáng)性的MVD值明顯高于表達(dá)陰性的MVD值（P < 0.05）。經(jīng)Spearman 秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中DcR3蛋白的表達(dá)量與CD105 標(biāo)記的MVD值存在線性正相關(guān)關(guān)系（r = 0.42，P < 0.05），表明宮頸癌組織中檢測(cè)到DcR3 蛋白的含量越高，說(shuō)明該組織中腫瘤微血管密度值則越高。

3 討論

宮頸癌的發(fā)展是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，亦是一個(gè)多基因、多因素共同作用的結(jié)果，其中癌基因激活或抑癌基因失活是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。為此，積極發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物及其相關(guān)因子，探索其在宮頸癌組織中的分布及表達(dá)，對(duì)宮頸癌患者的早期診斷、早期治療、轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)等可提供重要的理論依據(jù)。

誘導(dǎo)受體3（decoy receptor 3，DcR3）是一種分泌型的可溶性蛋白分子，屬腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員，也是最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃避和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡兩種功能。研究顯示[7]，DcR3通過(guò)與LIGHT、TLlA及Fas配體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃避和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及免疫逃逸密切相關(guān)。許多文獻(xiàn)報(bào)道顯示，DcR3基因在人類的多種惡性腫瘤或癌細(xì)胞株中呈高表達(dá)，也就是說(shuō)DcR3具有高度的腫瘤特異性。Pitti等[8]發(fā)現(xiàn)在人胚胎的腦、肺、肝和成人的脊髓、淋巴結(jié)、胃腸道等正常組織中可見(jiàn)少量的DcR3 mRNA表達(dá)，而在乳腺癌、肺癌及結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中則高表達(dá)。亦有研究顯示，在肝癌、胃癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中DcR3 基因也呈高表達(dá)[9-13]。DcR3在免疫耐受和抗凋亡中的作用及其在各種惡性腫瘤中的高表達(dá)均證明其與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。但是，縱觀國(guó)內(nèi)外有關(guān)宮頸癌組織中DcR3表達(dá)的報(bào)道較少。故本研究通過(guò)檢測(cè)DcR3蛋白在正常組織、CIN和宮頸癌組織中的表達(dá)量，結(jié)果顯示宮頸癌組織中DcR3的表達(dá)明顯高于CIN組和正常宮頸組，說(shuō)明DcR3的表達(dá)對(duì)宮頸癌的發(fā)展起了促進(jìn)作用。因此，檢測(cè)病變組織中DcR3的表達(dá)則可成為高危人群中早期篩查的一種免疫組化指標(biāo)。

實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)可分為兩個(gè)階段：無(wú)血管期和血管期。無(wú)血管期腫瘤直徑一般較小，主要通過(guò)滲透作用獲得自身所需養(yǎng)分，而在血管期則依賴新生毛細(xì)血管為其提供充足的養(yǎng)分[14]?？梢?jiàn)，在腫瘤形成的漫長(zhǎng)復(fù)雜過(guò)程中，不論起始還是終末階段，血管生成始終發(fā)揮著特殊的作用。運(yùn)用特異性抗體標(biāo)記腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)算微血管密度（MVD），即單位面積中的微血管數(shù)目，被認(rèn)為是目前反映腫瘤新生血管生成情況最直觀形象的方法。CD105作為一種新的血管內(nèi)皮標(biāo)志物，通過(guò)優(yōu)先結(jié)合在參與血管生成的各種組織或腫瘤組織邊緣血管起源的內(nèi)皮細(xì)胞上，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)TGF的反應(yīng)，且對(duì)小血管染色敏感，而對(duì)大血管染色并不敏感。因此對(duì)新生血管來(lái)說(shuō)，它是一個(gè)潛在的更具特異性的標(biāo)記物。故目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向了用CD105 標(biāo)記微血管的使用研究上。本研究結(jié)果表明：宮頸癌組織中CD105 標(biāo)記的MVD 值顯著高于CIN組和正常對(duì)照組，且CIN組織中CD105 標(biāo)記的MVD 值亦高于正常對(duì)照組，三組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 可見(jiàn)新生血管的生成促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展。然而，其血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)是否與DcR3抗凋亡作用有關(guān)呢？

為此，我們通過(guò)研究DcR3 蛋白和CD105 在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中DcR3 蛋白的表達(dá)量與CD105 標(biāo)記的MVD值存在線性正相關(guān)關(guān)系。其原因?yàn)椋阂环矫鍰cR3 與 TL1A結(jié)合，通過(guò)阻止 TL1A的促內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用而誘導(dǎo)新生血管產(chǎn)生；另一方面二者結(jié)合后還可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECS）的增生和遷移，通過(guò)影響基質(zhì)金屬蛋白酶-mRNA的表達(dá)及活性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生并形成新生血管，最終逃避免疫監(jiān)視。

綜上所述，本研究顯示DcR3可能參與了宮頸組織惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程；DcR3有可能作為一個(gè)新的生物學(xué)標(biāo)記物，成為判斷宮頸癌預(yù)后的參考指標(biāo)之一。然而宮頸癌的形成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜而漫長(zhǎng)的過(guò)程，二者之間的相互關(guān)系尚需進(jìn)一步研究，為探索惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新思路，為疾病的靶向治療提供一個(gè)新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2013-05-21）