大鼠心肌缺血再灌注后結(jié)蛋白的變化

【摘要】 目的：探討缺血再灌注損傷后大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)結(jié)蛋白分布狀況與含量的變化。方法：30只成年健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為缺血組、缺血再灌注組及假手術(shù)組。缺血組實(shí)施手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈30 min后即刻取材，再灌注組缺血后再灌注120 min后取材，假手術(shù)組實(shí)施同樣的手術(shù)過程但不結(jié)扎。應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)和圖像定量分析方法對大鼠心肌細(xì)胞結(jié)蛋白分布及含量的變化進(jìn)行研究。結(jié)果：缺血組和缺血再灌注組心肌結(jié)蛋白在心肌細(xì)胞內(nèi)的分布較假手術(shù)組的有序分布發(fā)生改變，變得無序而紊亂，心肌纖維橫紋不再清晰，變得斷續(xù)而模糊。缺血組和缺血再灌注組心肌結(jié)蛋白含量顯著低于對照組（P<0.05），缺血再灌注組顯著低于缺血組（P<0.05）。結(jié)論：心肌缺血和缺血再灌注均可造成心肌細(xì)胞結(jié)蛋白發(fā)生不同程度的降解，使心肌細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)繼發(fā)破壞，這可能是心肌機(jī)械功能異常的解剖學(xué)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 心?。?缺血再灌注； 結(jié)蛋白

Changes of Desmin after Rat Myocardial Ischemia Reperfusion/BAI Xue-mei.//Medical Innovation of China，2013，10（26）：006-008

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of ischemia reperfusion rat myocardial desmin distribution and content change.Method：30 healthy adult male SD rats were divided into ischemia group，ischemia reperfusion group and sham operation group.The ischemia group immediately sampled after the operation of coronary artery was ligated of 30 min，the reperfusion group sampled after reperfusion 120 min，the sham operation group to implement the same operation without ligation.Immunofluorescence staining and image quantitative analysis method were used to study the changes of myocardial desmin distribution and content in rats.Result：The myocardial desmin distribution of ischemia group and ischemia-reperfusion group became disordered，myocardial fiber stripes became blurred.Ischemia group and ischemia-reperfusion group myocardial desmin content was significantly lower than that in the control group （P<0.05），ischemia reperfusion group was significantly lower than that in ischemia group （P<0.05）.Conclusion：Myocardial ischemia and ischemia reperfusion injury can cause myocardial cell desmin degraded，the cytoskeleton structure was destroyed，which may be the anatomical basis of myocardial mechanical dysfunction.

【Key words】 Myocardium； Ischemia reperfusion； Desmin

First-author’s address：The Eighth Hospital of Baotou City，Baotou 014040，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.26.003

缺血組織恢復(fù)血流灌注時，導(dǎo)致再灌注區(qū)細(xì)胞和局部血管網(wǎng)顯著的病理生理變化，這些變化共同作用可促進(jìn)進(jìn)一步的組織損傷，該病理過程稱為缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury）。缺血心肌的再灌注損傷可通過一定的病理學(xué)機(jī)制導(dǎo)致某些執(zhí)行特定功能的蛋白質(zhì)的降解和表達(dá)異常，繼發(fā)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，從而影響心肌正常的生理功能[1]。結(jié)蛋白（desmin）為細(xì)胞骨架蛋白，大量存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，結(jié)蛋白中間絲將Z帶與細(xì)胞膜及細(xì)胞核相連接，這些細(xì)絲對肌絲的組成和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)蛋白對于維持肌肉正常的機(jī)械功能是必需的，結(jié)蛋白的破壞或表達(dá)異?？赡茉斐杉∪鈾C(jī)械功能的障礙[2]。

本研究制定了缺血再灌注實(shí)驗(yàn)動物模型，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠在缺血后即刻和再灌注后心肌結(jié)蛋白分布狀況及含量的變化，試圖為探討缺血后及缺血再灌注后心肌損傷及其機(jī)械功能異常的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選用健康成年雄性SD品系大鼠30只，體重（260±8）g。將選用大鼠隨機(jī)分為缺血組、缺血再灌注組和假手術(shù)組，每組10只。兩組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠心肌缺血再灌注模型的建立 缺血再灌注組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（1 ml/100 g體重）麻醉，利用氣管插管接鼠類動物呼吸機(jī)進(jìn)行人工呼吸（潮氣量20 ml/kg，頻率60～80次/min），心電監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測其心電變化。開胸后于左冠狀動脈前降支起始2～3 mm處用4.0手術(shù)縫合線穿過動脈深面?zhèn)溆?，用一?xì)小柔軟膠片墊于血管與結(jié)扎線之間，待呼吸、血壓平穩(wěn)15 min后結(jié)扎，30 min后剪除結(jié)扎線再灌注120 min后處死大鼠。結(jié)扎成功參照標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)端動脈分布區(qū)域心肌顏色發(fā)紺，心電圖QRS波群增高增寬，ST段抬高。再灌注成功參照標(biāo)準(zhǔn)：缺血部位心肌顏色恢復(fù)至正常水平，抬高的ST段至少下降50%。缺血組結(jié)扎30 min后即刻處死取材。假手術(shù)組手術(shù)過程參照實(shí)驗(yàn)組，差別是在穿線后不結(jié)扎，30 min后取下縫合線，關(guān)閉胸腔，120 min后處死大鼠。

1.2.2 大鼠心肌取材切片 處死大鼠后迅速取出心臟，生理鹽水清洗后迅速于梗死區(qū)域（假手術(shù)組在相同區(qū)域）切取心肌組織，置于冰凍切片機(jī)專用標(biāo)本盤，滴加OCT包埋劑后連同標(biāo)本盤迅速置于液氮內(nèi)冷凍20 s后轉(zhuǎn)入冰凍切片機(jī)切片箱，切取7 μm厚的冰凍切片置于-70 ℃超低溫冰箱備用。

1.2.3 心肌冰凍切片的免疫熒光染色 結(jié)蛋白于心肌細(xì)胞內(nèi)及閏盤處表達(dá)，選用FITC熒光標(biāo)記，具體步驟如下：（1）將冰箱保存的冰凍切片取出，室溫復(fù)溫30 min后用4 ℃丙酮液固定10 min，用PBS緩沖液漂洗3次，5 min/次；（2）滴加10%正常山羊血清封閉，室溫下孵育10 min；（3）傾去血清后勿洗，滴加經(jīng)PBS 1：100稀釋的小鼠抗大鼠結(jié)蛋白抗體，4 ℃過夜，用PBS緩沖液漂洗3次，5 min/次；（4）滴加經(jīng)PBS 1：100稀釋的FITC標(biāo)記兔抗小鼠IgG，37 ℃下孵育1 min，用PBS緩沖液漂洗3次，5 min/次；（5）滴加60%的緩沖甘油封片。

1.2.4 免疫熒光圖像的采集和分析 使用Leica AS MDW激光共聚焦成像工作站采集結(jié)蛋白的免疫熒光標(biāo)記圖像，所有圖像均采用同一曝光時間及相同的條件采集。每張切片于缺血區(qū)域隨機(jī)選取心肌縱切視野5個，將數(shù)字圖像儲存以待分析。應(yīng)用JD801圖像分析系統(tǒng)對數(shù)字圖像進(jìn)行定量分析，測定結(jié)蛋白陽性表達(dá)部位的積分灰度值，以積分灰度值的大小代表結(jié)蛋白表達(dá)量的多少，對缺血再灌注損傷后心肌結(jié)蛋白進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 圖片定量分析采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌結(jié)蛋白免疫熒光圖像 圖1為假手術(shù)組心肌縱切的結(jié)蛋白免疫熒光標(biāo)記圖像，綠色點(diǎn)狀和塊狀熒光斑即為結(jié)蛋白，可見假手術(shù)組心肌結(jié)蛋白在心肌細(xì)胞的胞漿內(nèi)均勻的分布，在心肌細(xì)胞閏盤處分布增多，圖片中可見心肌纖維橫紋清晰。圖2和圖3為缺血后即刻和再灌注后120 min后的結(jié)蛋白免疫熒光圖像，可見在不同心肌細(xì)胞或者同一心肌細(xì)胞的不同部位結(jié)蛋白分布不再均一，呈現(xiàn)局部或增多或減少甚至缺失，兩組心肌纖維橫紋亦變得模糊不清。

2.2 大鼠心肌結(jié)蛋白的免疫熒光圖像定量分析 經(jīng)計算機(jī)軟件的定量分析，假手術(shù)組缺血區(qū)結(jié)蛋白含量為（2 317 358±

329 937），缺血組缺血區(qū)結(jié)蛋白含量為（2 168 051±305 137），

缺血再灌組缺血區(qū)結(jié)蛋白含量為（1 986 050±335 629）。由此可得，缺血組和缺血再灌注組心肌結(jié)蛋白含量顯著低于假手術(shù)組，缺血再灌注組心肌結(jié)蛋白含量顯著低于缺血組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 正常心?。偈中g(shù)組）結(jié)蛋白免疫熒光圖像 （×200）

注：綠色點(diǎn)狀或塊狀熒光斑為結(jié)蛋白，可見結(jié)蛋白均勻分布于心肌細(xì)胞內(nèi)，在閏盤處分布增多，心肌纖維橫紋清晰可見

圖2 缺血組心肌結(jié)蛋白免疫熒光圖像 （×200）

注：結(jié)蛋白分布不再均一，呈現(xiàn)局部或增多或減少甚至缺失，兩組心肌纖維橫紋亦變得模糊不清

圖3 缺血再灌注組心肌結(jié)蛋白免疫熒光圖像 （×200）

注：結(jié)蛋白分布不再均一，呈現(xiàn)局部或增多或減少甚至缺失，兩組心肌纖維橫紋亦變得模糊不清

3 討論

在心肌細(xì)胞，結(jié)蛋白（desmin）中間絲主要存在于Z帶和閏盤，排列成相互交錯的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將Z帶與細(xì)胞膜及細(xì)胞核連接，從而使眾多的單個肌原纖維連接起來，將所有肌原纖維的單個收縮運(yùn)動機(jī)械地整合在一起，形成合力。同時，結(jié)蛋白在細(xì)胞內(nèi)收縮蛋白間架起或平行或交錯的網(wǎng)絡(luò)框架結(jié)構(gòu)，使收縮力沿纖維軸方向傳遞，限制肌節(jié)在肌肉收縮過程中被過度牽拉。有學(xué)者利用結(jié)蛋白基因敲除小鼠模型證明結(jié)蛋白缺失可導(dǎo)致心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)異常改變、心肌細(xì)胞凋亡以及心肌機(jī)械功能障礙，這表明結(jié)蛋白對于維持心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、保證心肌正常機(jī)械功能功能是必需的[3]。

陳小波等[4]研究發(fā)現(xiàn)，心肌挫傷后早期以細(xì)胞的機(jī)械損傷為主，之后細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高，繼而由其介導(dǎo)的心肌結(jié)蛋白降解增加。心肌缺血再灌注損傷后的病理改變與前者類似，細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心肌缺血再灌注損傷的主要病理機(jī)制，超量Ca2+與執(zhí)行特定功能的各種相關(guān)蛋白結(jié)合導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡啟動以及損傷的心肌細(xì)胞進(jìn)行電重構(gòu)，還可導(dǎo)致細(xì)胞膜相結(jié)構(gòu)的破壞[5]。心肌缺血再灌注損傷后由于Ca2+激活了某些細(xì)胞骨架蛋白的降解，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受到損壞從而導(dǎo)致心肌機(jī)械功能的異常，即心肌頓抑。心肌頓抑（myocardial stunning）系指心肌缺血再灌注后，即使沒有不可逆損害，即使冠脈血流恢復(fù)或接近正常水平，但仍持續(xù)存在的心肌機(jī)械功能異常，此種功能障礙是完全可逆的，只要給予足夠的時間，心肌機(jī)械功能就可以完全恢復(fù)。由此可見，心肌頓抑是由于心肌缺血再灌注造成的可逆性損傷[6-9]。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生頓抑的豚鼠心肌內(nèi)，由于Ca2+激活了細(xì)胞內(nèi)的鈣激活蛋白酶從而導(dǎo)致了心肌收縮功能障礙，致使諸如結(jié)蛋白、血影蛋白及α-輔肌蛋白等Z線相關(guān)蛋白的含量減少，從而反過來證明結(jié)蛋白等Z線相關(guān)蛋白的降解在心肌頓抑的發(fā)生中行使了重要的作用[10-11]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血組和缺血再灌組心肌結(jié)蛋白的分布狀況發(fā)生了很大的變化，可見在不同心肌細(xì)胞或者同一心肌細(xì)胞的不同部位結(jié)蛋白分布不再均一，呈現(xiàn)局部或增多或減少甚至缺失，心肌纖維橫紋亦變得模糊不清。兩組心肌結(jié)蛋白含量顯著下降，缺血再灌注組心肌結(jié)蛋白含量下降更為明顯，這說明缺血后心肌結(jié)蛋白發(fā)生了一定程度的降解，而缺血后的再灌注則加重了心肌的損傷促進(jìn)了結(jié)蛋白的降解。心肌的缺血再灌注損傷可造成心肌結(jié)蛋白的大量降解，致使細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，從而導(dǎo)致心肌機(jī)械功能的暫時障礙，即心肌頓抑。缺血再灌注后心肌結(jié)蛋白的降解造成心肌細(xì)胞骨架三維結(jié)構(gòu)的破壞，而細(xì)胞骨架通過錨定諸如線粒體、細(xì)胞核、肌絲、高爾基體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來維持細(xì)胞的穩(wěn)定性，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的破壞可能使細(xì)胞膜以及其他細(xì)胞器對各種損傷因子的敏感性增強(qiáng)，使細(xì)胞更易受到這些損傷因子的攻擊而損傷；也就是說結(jié)蛋白的降解既是心肌缺血再灌注損傷的一個結(jié)果，又是心肌損傷進(jìn)一步發(fā)展進(jìn)而導(dǎo)致心肌機(jī)械功能障礙的因素。

心肌缺血再灌注損傷可造成心肌結(jié)蛋白的降解，從而改變結(jié)蛋白在心肌細(xì)胞的分布狀況，即原有的均勻分布的模式轉(zhuǎn)變?yōu)椴糠中募〗Y(jié)蛋白減少或缺失，心肌纖維橫紋變得模糊不清。結(jié)蛋白的降解導(dǎo)致心肌細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)遭到破壞。心肌缺血再灌注后心肌結(jié)蛋白的上述改變可能是導(dǎo)致的心肌機(jī)械功能異常的解剖學(xué)基礎(chǔ)。

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（本文編輯：歐麗）