兔腦血管痙攣前后基底動(dòng)脈中PDEⅤ表達(dá)變化

【摘要】 目的：探討兔蛛網(wǎng)膜下腔出血腦血管痙攣前后基底動(dòng)脈中PDEⅤ的表達(dá)變化。方法：制作腦血管痙攣動(dòng)物模型，空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與SAH組均于制模后第3天行TCD與選擇性椎-基底動(dòng)脈造影，檢測(cè)兔腦血管痙攣的發(fā)生及變化，檢測(cè)完后，取其基底動(dòng)脈，制成病理切片備用。通過(guò)免疫組化檢測(cè)兔基底動(dòng)脈中PDEⅤ的表達(dá)。結(jié)果：各配伍組中TCD測(cè)得的基底動(dòng)脈血流速度、DSA測(cè)得的基底動(dòng)脈管徑值及免疫組化陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物的SUM值不等或不全相等（P<0.05），經(jīng)Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)對(duì)各配伍組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，SAH組與空白對(duì)照組、SAH組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組TCD測(cè)得的基底動(dòng)脈血流速度、DSA測(cè)得的基底動(dòng)脈管徑值及免疫組化陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物的SUM值不等（P<0.05），空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組TCD測(cè)得的基底動(dòng)脈血流速度、DSA測(cè)得的基底動(dòng)脈管徑值及免疫組化陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物的SUM值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：兔蛛網(wǎng)膜下腔出血腦血管痙攣后PDEⅤ在其基底動(dòng)脈中明顯表達(dá)，推測(cè)PDEⅤ表達(dá)可能與腦血管痙攣發(fā)生有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 蛛網(wǎng)膜下腔出血； 腦血管痙攣； 磷酸二酯酶Ⅴ； 兔

腦血管痙攣（CVS）作為蛛網(wǎng)膜下腔出血最嚴(yán)重的并發(fā)癥，是蛛網(wǎng)膜下腔出血致死和致殘的首要原因。研究認(rèn)為，蛛網(wǎng)膜下腔出血后氧合血紅蛋白使血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO減少，繼而通過(guò)NO-GC-cGMP途徑使血管平滑肌細(xì)胞中cGMP含量減少，引起腦血管痙攣[1]。鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（GC）和磷酸二酯酶（PDEs）是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)cGMP含量的兩種相互拮抗的重要生物酶，他們的含量及活性變化直接影響細(xì)胞內(nèi)cGMP含量，GC含量增多或活性增強(qiáng)可使細(xì)胞內(nèi)cGMP含量減少，PDEs含量增大或活性增強(qiáng)可使細(xì)胞內(nèi)cGMP含量增加，反之亦然。目前，對(duì)通過(guò)增加NO產(chǎn)生而使cGMP含量增多來(lái)緩解腦血管痙攣的研究較多，而對(duì)通過(guò)抑制磷酸二酯酶活性使cGMP降解減少來(lái)緩解腦血管痙攣的研究較少。筆者通過(guò)“枕大池二次注血法” 制成兔腦血管痙攣模型[2]，探討兔蛛網(wǎng)膜下腔出血腦血管痙攣前后基底動(dòng)脈中PDEⅤ的表達(dá)變化，判斷其與腦血管痙攣的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭大白兔（山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) （1）分組及制模：新西蘭大白兔24只，雄性，體重2.5～3.0 kg，按照體重接近的條件配成8個(gè)配伍組，然后將各配伍組中3只新西蘭大白兔隨機(jī)分配到3個(gè)組，每組各8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用10%水合氯醛（3 ml/kg，腹腔注射）和速眠新（0.2 ml/kg，肌肉注射）麻醉，采用枕大池二次注血法制成兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣模型，SAH組注入枕大池的為自體動(dòng)脈血（0.5 ml/kg），實(shí)驗(yàn)對(duì)照組注入枕大池的為生理鹽水（0.5 ml/kg），空白對(duì)照組無(wú)操作。兩次操作間隔時(shí)間為48 h，規(guī)定第1天為第2次操作后24 h，以此類推。

（2） TCD及選擇性椎-基底動(dòng)脈造影：空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和SAH組均于制模后第3天行TCD與選擇性椎-基底動(dòng)脈造影檢查[2]。TCD取俯臥位，充分暴露頸部，于枕外結(jié)節(jié)下2 cm處，用2MHzTCD探頭檢查基底動(dòng)脈流速[TCD參數(shù)調(diào)節(jié)為：V 10 mm，D（27±3）cm，W 107 mW/cm2]，保留TCD測(cè)得的血流頻譜及其平均流速（Vm） （圖1、圖2）。

DSA 取仰臥位，暴露右側(cè)腹股溝，游離右側(cè)股動(dòng)脈，穿刺股動(dòng)脈，交換置入Prower-14微導(dǎo)管，微導(dǎo)絲導(dǎo)引下將微導(dǎo)管選至左側(cè)椎動(dòng)脈內(nèi)，行椎-基底動(dòng)脈造影檢查，造影結(jié)束后，撤出微導(dǎo)管，結(jié)扎股動(dòng)脈，所用物品均肝素化。雙盲法測(cè)量基底動(dòng)脈上、中、下段的血管直徑，取3點(diǎn)平均值作為基底動(dòng)脈直徑（圖3、圖4）。

（3）取材：完成上述兩項(xiàng)操作后，將動(dòng)物處死、灌注，取其基底動(dòng)脈作為標(biāo)本，將標(biāo)本用10%的福爾馬林浸泡1周，按常規(guī)方法制成病理切片，以備后用。

1.2.2 免疫組化 （1）切片脫蠟及水化；（ 2）微波熱修復(fù)；（3）3%H2O2水孵育、PBS液沖洗，阻斷過(guò)氧化物酶；（4）滴加一抗（1：750稀釋的山羊抗人PDEⅤ抗體）；（5）滴加二抗；（6）顯色；（7）蘇木精復(fù)染；（8）乙醇脫水；（9）二甲苯透明；（10）封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用（x±s）表示，運(yùn)用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCD與選擇性椎-基底動(dòng)脈造影的檢測(cè)結(jié)果 TCD測(cè)得空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、SAH組兔基底動(dòng)脈血流速度的平均值分別為：（ 28.71±2.6）cm/s、（27.2±3.1）cm/s、

（51.8±4.9）cm/s。DSA測(cè)得的空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、SAH組兔基底動(dòng)脈管徑平均值分別為：（ 0.72±0.18）mm、（0.81±0.13）mm、（0.39±0.22）mm。經(jīng)Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)對(duì)三組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，SAH組與空白對(duì)照組、SAH組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組TCD測(cè)得的基底動(dòng)脈血流速度、DSA測(cè)得的基底動(dòng)脈管徑值不等（P<0.05），空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組TCD測(cè)得的基底動(dòng)脈血流速度、DSA測(cè)得的基底動(dòng)脈管徑值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 免疫組化 每個(gè)標(biāo)本取3張相同部位的切片，每張切片取不同的3個(gè)視野進(jìn)行照像（Olympus光學(xué)顯微鏡，200倍），用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定PDEⅤ免疫表達(dá)物陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物IOD的SUM值表達(dá)，求其算術(shù)平均值。免疫組化測(cè)得的空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、SAH組兔基底動(dòng)脈PDEⅤ表達(dá)分別為：（63.86±4.6）、（74.22±3.88）、（181.65±8.92）。經(jīng)Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)對(duì)三組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，SAH組與空白對(duì)照組、SAH組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組SUM值不等（P<0.05），空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組SUM值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。SAH組可見(jiàn)PDEⅤ在血管平滑肌內(nèi)膜及中膜中明顯表達(dá)，空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中未見(jiàn)PDEⅤ明顯表達(dá)（圖5、圖6）。

3 討論

腦血管痙攣是蛛網(wǎng)膜下腔出血最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可引起顱內(nèi)壓增高，腦血流量降低、灌注不足，導(dǎo)致局部腦組織缺血或遲發(fā)性腦損害，是自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者致死致殘的首要原因。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的“枕大池二次注血法”制成兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣模型，用TCD和DSA證實(shí)腦血管痙攣發(fā)生后，將動(dòng)物模型的基底動(dòng)脈制成病理切片，通過(guò)免疫組化測(cè)定腦血管痙攣動(dòng)物模型基底動(dòng)脈中PDEV的表達(dá)，從而判定其與腦血管痙攣發(fā)生的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證實(shí)制模成功后24 h腦血管痙攣即開(kāi)始出現(xiàn)，3 d時(shí)腦血管痙攣的表現(xiàn)達(dá)到峰值。該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符合[3]。

磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs）是人體生理代謝活動(dòng)中一種重要的酶[4]，廣泛分布于人體各個(gè)組織器官的細(xì)胞內(nèi)，其作用主要是通過(guò)催化環(huán)核苷酸水解而改變細(xì)胞內(nèi)cAMP及cGMP濃度。后兩者是細(xì)胞生理代謝活動(dòng)中重要的第二信使，通過(guò)其濃度及活性調(diào)節(jié)細(xì)胞的重要功能。細(xì)胞內(nèi)cAMP和cGMP水平變化主要與以下三種酶有關(guān)：腺苷酸環(huán)化酶（AC）、鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（GC）和磷酸二酯酶（PDEs），這三種酶的濃度及活性調(diào)節(jié)變化，使細(xì)胞內(nèi)cAMP和cGMP水平發(fā)生改變，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能。磷酸二酯酶包括11種同工酶類型，不同磷酸二酯酶同工酶有著不同的調(diào)節(jié)機(jī)制及底物選擇性[5]。PDEIV、VII、VIII主要水解cAMP，PDEV、VI、IX主要水解cGMP。PDEⅤ與血管關(guān)系最為密切，其含量減少可使血管擴(kuò)張，其抑制劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床 [6]。

血管源性舒張因子可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）或鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（GC），后兩者可分別水解ATP、GTP生成cAMP和cGMP，cAMP可抑制蛋白激酶A活性，使血管平滑肌細(xì)胞舒張；cGMP能使細(xì)胞膜上的Ca2+通道關(guān)閉、肌漿網(wǎng)上Ca2+泵激活，使細(xì)胞內(nèi)游離鈣減少，平滑肌舒張[7]。根據(jù)以上機(jī)理，增加血管平滑肌細(xì)胞中cAMP和cGMP濃度（如硝普鈉）、減少cAMP和cGMP降解（應(yīng)用PDEs抑制劑如罌粟堿）都可以使血管舒張[8-9]。SAH后血管原性舒張因子減少，PDEs表達(dá)增多、活性增強(qiáng)，使血管平滑肌細(xì)胞中cAMP和cGMP生成減少、降解增加而導(dǎo)致其濃度降低，引起血管平滑肌收縮，發(fā)生腦血管痙攣。對(duì)SAH動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)：模型動(dòng)物基底動(dòng)脈PDEⅤ表達(dá)較對(duì)照組明顯增多，應(yīng)用枸櫞酸西地那非（PDEⅤ抑制劑）后，造影證實(shí)CVS得到緩解，認(rèn)為血管平滑肌細(xì)胞中PDEⅤ表達(dá)增多與SAH后CVS發(fā)生有關(guān)，其抑制劑可以緩解CVS。目前臨床應(yīng)用緩解血管痙攣的硝普鈉、罌粟堿效果均比較肯定。目前國(guó)外已將米力農(nóng)（PDE III抑制劑）、西地那非（PDEⅤ抑制劑）應(yīng)用于臨床，治療腦血管痙攣，效果肯定且無(wú)不良反應(yīng)。另外PDEs抑制劑可擴(kuò)張血管，改善循環(huán)，也被用于治療陽(yáng)痿[10]、肺動(dòng)脈高壓[11]。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的基底動(dòng)脈中PDEV廣泛表達(dá)，表達(dá)部位主要集中在內(nèi)膜和中膜，而對(duì)照組標(biāo)本中均未見(jiàn)PDEⅤ明顯表達(dá)，通過(guò)計(jì)數(shù)軟件分析，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），因此推測(cè)PDEⅤ與蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣發(fā)生有關(guān)。PDEⅤ抑制劑可能對(duì)腦血管痙攣治療有效，可能成為治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的新一代藥物。

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（本文編輯：陳丹云）