富營養(yǎng)化水體中微囊藻毒素的檢測方法研究進展

摘 要：微囊藻毒素（Microcystins，MCs）為富營養(yǎng)化水體中最常見的藻類毒素，它的危害性在飲用水中的存在，迫切需要建立一種工作原理簡單易行、分析速度快、靈敏度較高的統(tǒng)一的檢測方法，以便對水體中特別是飲用水源中的微囊藻毒素進行檢測。該文介紹了近年來發(fā)展起來的幾類微囊藻毒素檢測技術(shù)，以及微囊藻毒素檢測技術(shù)尚要解決的問題和未來的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素；檢測方法；研究進展

中圖分類號 Q-31 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）16-19-04

近些年來，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，我國有很多天然湖泊、水庫受到不同程度的有機污染，存在著嚴重的富營養(yǎng)化現(xiàn)象[1]。富營養(yǎng)化水體中藍藻的大量繁殖會形成有害的藍藻水華（HAB，harmful algal bloom），大規(guī)模的藍藻水華不但會耗掉水中大量的溶解氧，破壞水生生態(tài)系統(tǒng)健康與平衡，并且一些有毒藍藻會向水體中釋放多種不同類型的藻毒素，對水生生物、人類飲水安全、人類健康都構(gòu)成了嚴重的威脅。在已發(fā)現(xiàn)的各種不同類型的藻毒素中，微囊藻毒（Microcystins，MCs）是目前已知的一種在藍藻水華污染中分布范圍最廣、出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴重的藻毒素種類[2]。通過流行病學調(diào)查、動物中毒以及毒理學研究表明，MCs對人和水生動物具有很高的毒性并且具有潛在危害，嚴重威脅人類的生命安全與健康[3]。因此，水體中MCs的含量已經(jīng)被多個國家和組織作為衡量水質(zhì)標準的一個重要指標，如世界衛(wèi)生組織和我國生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范（GB5749-2006）均規(guī)定，飲用水中的MCs濃度不得高于1.0μg/L（MC-LR）[4]。如何控制藍藻的過度生長繁殖以及有效降解藻毒素是世界各國共同面臨的難題，而快速、靈敏、準確的富營養(yǎng)化水體中MCs檢測方法是進一步研究MCs在環(huán)境中的分布和藍藻水華控制方法的基礎(chǔ)。本文對目前主要的MCs分析檢測方法進行了綜合的分析、比較。

1 微囊藻毒素簡介

MCs是由藍藻門中的微囊藻屬（Microcystis）、念珠藻屬（Nostoc）、魚腥藻屬（Anabaena）等產(chǎn)生的具有生物學活性的環(huán)狀七肽物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示[5]。Adda結(jié)構(gòu)是MCs生理活性的基礎(chǔ)，而由于X、Z（兩種可變的L-氨基酸）的不同可形成80多種不同的MCs異構(gòu)體，其中最常見、分布最廣泛、毒性最大的為MC-LR（L代表亮氨酸、R代表精氨酸）。動物中毒試驗和流行病學研究表明，MCs對人以及多種生物具有不同的毒性作用，其中MC-LR具有很強的肝毒性，可破壞肝細胞的結(jié)構(gòu)，導致肝細胞的凋亡、壞死。俞順章等通過流行病學調(diào)查我國原發(fā)性肝癌與飲用水之間聯(lián)系時發(fā)現(xiàn)，MCs是趨肝致肝炎和肝癌的促癌劑[6]。此外，MCs對人體的腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)都有不同程度的毒害作用。

2 微囊藻毒檢測方法

鑒于MCs的巨大危害性，有效的分析檢測手段對于維護環(huán)境安全和人類健康有著重要的意義。不同程度富營養(yǎng)化的水體中都會有一定濃度的MCs存在，但這些痕量MCs的含量一般僅在μg甚至ng級水平，常規(guī)的分析化學很難快速、精確檢測。目前，國內(nèi)外普遍采用的檢測方法可以歸納為：物理化學檢測法、生物檢測法和生物化學檢測法[7]。

2.1 生物檢測法

2.1.1 動物毒性檢測法 傳統(tǒng)的生物分析法采用的是美國分析化學家協(xié)會（AOAC）在1985年推薦的檢測貝類毒素的小鼠急性毒性試驗法。該方法利用純化的MCs對小鼠進行腹腔注射或口腔灌喂，根據(jù)其生理病變和半致死量（LD50）可初步確定其毒性[8]。該方法簡便快速，能較為直觀地檢測MCs的毒性。除了小鼠外，其他動物例如鴨子、蝦以及魚類等動物的毒性試驗和生物分析也有過報道。王春雨等將純化的MCs對鴨子進行腹腔注射發(fā)現(xiàn)，MCs對成鴨的LD50為84.82μg/kg，對幼鴨的LD50為64.723 2μg/kg[9]，但該方法靈敏度較低，特異性不高，無法定量檢測。

2.1.2 細胞毒性檢測法 細胞毒性檢測技術(shù)是利用MCs對細胞的毒害作用后細胞形態(tài)以及細胞內(nèi)相應(yīng)物質(zhì)的變化來檢測MCs的一種方法。施瑋等發(fā)現(xiàn)MCs可使大鼠原代肝細胞的增殖、細胞周期、凋亡發(fā)生較顯著的改變，細胞面積、凋亡細胞的比率與MCs呈現(xiàn)良好的劑量反應(yīng)關(guān)系[10]。谷康定在研究MCs對傳代細胞的毒性時發(fā)現(xiàn)，當KB細胞在培養(yǎng)96h后，MCs濃度超過18.8μg/mL時，細胞內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）溢出增加，并與MCs濃度呈典型劑量-反應(yīng)關(guān)系[11]。相對于動物實驗，該方法更加經(jīng)濟和快捷，并且能夠定量的檢測，但對試驗條件和場所要求較高。

在已建立的檢測MCs多種生物系統(tǒng)中，除了傳統(tǒng)的動植物以及細胞以外，還有利用細菌進行毒性試驗研究。楊翠云等[12]研究不同濃度MCs對E.coli和Bacillus subtilis生長及生理生化特性影響時發(fā)現(xiàn)，MCs對E.coli和Bacillus subtilis的生長和細胞活性具有一定的劑量效應(yīng)。但關(guān)于MCs對微生物的毒性效應(yīng)及作用機制的報道目前較少，還需要進一步進行研究。

2.2 物理化學檢測法 MCs常用的物理化學檢測方法主要有：高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、2-甲基-3-甲氧基-4-苯丁酸（MMPB）等[13]。

2.2.1 高效液相色譜法 高效液相色譜（HPLC）技術(shù)是目前歐美等發(fā)達國家廣泛采用的一種MCs的分離、鑒定和定量檢測方法，同時也是我國在水質(zhì)監(jiān)測領(lǐng)域中MCs檢測的國標方法（GB/T 20466-2006）。HPLC檢測MCs的極限為1mg/L左右，而在自然水體和飲用水中MCs的含量極低（一般低于1μg/L）并且存在多種干擾物質(zhì)，因此應(yīng)用HPLC檢測MCs前，首先要將藻毒素提取液或待測水樣通過固相萃取技術(shù)（SPE）富集、純化；然后將純化的MCs通過紫外（UV）或光電二極管陣列檢測器（PDA）進行檢測，將樣品色譜圖的保留時間與標準MCs進行對比可鑒定出被測毒素的類型，根據(jù)峰面積的大小對比則可定量分析，檢出限能達到0.1μg/L。正是由于HPLC技術(shù)具有檢測MCs準確性高，并且可以對不同的MCs異構(gòu)體進行分析檢測等優(yōu)點，已成為MCs的一種常規(guī)方法[14]。目前，關(guān)于HPLC測定MCs的研究報道都集中在對待測樣品的前處理、MCs的純化、固相萃取柱的選擇、檢測器的選用和色譜分析條件的優(yōu)化等方面。薛罡等對MCs的萃取富集和洗脫條件進行優(yōu)化，以甲醇/TFA-水溶液作為流動相，選用10%的甲醇水溶液作為淋洗液，使HPLC檢測限達到0.01～0.05μg/L[15]；梁麗麗等選用XAD-2樹脂為富集樹脂，采用V（0.1%TFA）：V（甲醇）=42：58的混合溶液為流動相進行等度洗脫，可使MCs回收率達到90%以上，檢出限達到0.05μg/L[16]；張立將用甲醇-0.05%三氟乙酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，對于MC-RR和MC-LR取得較好分離效果，水樣檢出限可達0.02μg/L[17]。

目前，HPLC方法的普及應(yīng)用仍受到諸多限制，一方面HPLC法需要使用昂貴的大型儀器設(shè)備和配備專業(yè)操作技術(shù)人員；其次，HPLC檢測技術(shù)需要標準MCs用來獲得標準曲線和吸收峰值，而目前除了MC-RR、MC-LR等少數(shù)的標準MCs外，其余的80多種MCs異構(gòu)體大多缺乏標準毒素。

2.2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 標準MCs的缺乏限制了HPLC的應(yīng)用范圍，1990年Quilliam等人利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)很好的解決了這個問題[18]。LC-MS將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實現(xiàn)對水體中MCs更準確的定量和定性分析，并且同時也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。即使沒有標準MCs，只要知道這種MCs的分子量，就可對其進行定性定量檢測分析。王蕾等建立的高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜（HPLC-EI-MS）測定藻樣中MC-LR的方法，絕對檢出限為25pg，回收率達到了70%以上[19]。Liming Cong等[20]建立的液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)能同時檢測地表水中4種MCs異構(gòu)體，MC-RR，MC-LR，MC-LW，MC-LF的檢出限分別為0.16μg/L，0.04μg/L，2.0μg/L，1.0μg/L，具有靈敏度高，專屬性強等特點。近年來，隨著LC-MS技術(shù)的完善和普及，LC-MS以其定分子量準確、快速、靈敏度高等優(yōu)點在MCs檢測中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

2.2.3 MMPB法 雖然MCs種類繁多有很多異構(gòu)體，但每種異構(gòu)體的分子中都只有一個Adda側(cè)鏈，因此，日本學者Tomoharu Sano[21]建立了一種檢測MCs總量的方法。首先利用KMnO4和NaIO4對MCs進行氧化，將Adda上的共軛雙鍵氧化斷裂后得到一種共同的產(chǎn)物2-甲基-3-甲氧基-4-苯丁酸（MMPB），然后通過GC對MMPB進行分析檢測，可獲得MCs總濃度[22]。該方法所需樣品量少、靈敏度高，檢測限度為pg級，但較為耗時。為了克服這一缺點，Harada等用O3在低溫條件下（-78℃）氧化懸浮在甲醇溶液中的藻細胞，然后用熱激發(fā)液相色譜-質(zhì)譜進行檢測，可將檢測時間縮短在30min之內(nèi)。樊潔等通過優(yōu)化溫度、pH值和氧化劑用量等反應(yīng)條件來改進和完善MMPB法發(fā)現(xiàn)，最佳的實驗條件為：pH=9、KMnO4的初始濃度為0.015 6mol/L、初始反應(yīng)溫度為2℃；在此實驗條件下MMPB回收率最高，所用時間最短，MCs檢出限為0.022 5μg/L，回收率為93.5%[23]。

2.3 生物化學檢測法

2.3.1 酶聯(lián)免疫分析法 酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是現(xiàn)代應(yīng)用最為廣泛的一種免疫檢測方法，基本原理是將特異性的抗原抗體反應(yīng)與酶的高效催化作用相結(jié)合。自1990年Chu[24]開發(fā)了可以滿足MC-LR檢測的高靈敏度兔多克隆抗體以來，ELISA已被廣泛的應(yīng)用于環(huán)境中MCs的檢測。我國在2006年制定的MCs檢測的國家標準（GB/T 20466-2006）中已經(jīng)把ELISA作為水中MCs測定的基本方法。目前，常用的商品化ELISA試劑盒多采用直接競爭性ELISA方法，MCs檢測試劑盒由可以和MCs及MCs酶標記物結(jié)合的多克隆抗體制成，樣品中的MCs與MCs酶標記物競爭結(jié)合數(shù)量有限的抗體結(jié)點，樣品中MCs含量低的則酶標記物結(jié)合得多，反之則酶標記物結(jié)合得少，最后通過酶與生色底物的反應(yīng)來觀察檢測。ELISA中最常用的酶為辣根過氧化酶（HRP）和大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）。ELISA是一種非常簡便、高效、快速的MCs檢測方法，蔡正森對ELISA法與HPLC法檢測水中MCs含量的異同進行比較后發(fā)現(xiàn)，ELISA法和HPLC法相對誤差平均值為8.62%，在加標濃度為0.5～12.5μg/L時，ELISA法回收率為94.84%～116.51%，HPLC法回收率為86.14%～92.18%，兩種方法都具有良好的相關(guān)性[25]。

2.3.2 蛋白磷酸酶抑制分析（PPIA） 對MCs毒性研究表明，MCs能特異性地抑制蛋白磷酸酶1（PPl）和蛋白磷酸酶2A（PP2A）的活性。因此，根據(jù)蛋白磷酸酶酶活性抑制程度就可對MCs進行定量的測定。該法簡便、準確，檢測下限可以達到0.02～0.5μg/L[26]。根據(jù)所選底物和檢測方法的不同，分為同位素法、熒光法和比色法。王亞等分別應(yīng)用熒光蛋白蛋白磷酸晦抑制分析（F-PPIA）和HPLC方法檢測太湖水華中的MCs含量，兩種方法檢測結(jié)果相關(guān)性較好（r=0.967 8，P<0.001），但F-PPIA法水樣需要量少（10～200μL）、檢測耗時短（1～2h）、更適合基層檢測部門使用[27]。

3 總結(jié)與展望

表1 微囊藻毒素檢測方法的優(yōu)缺點

[檢測方法＼優(yōu)點＼缺點＼檢測精度＼細胞毒素檢測＼操作簡單，結(jié)果直觀、快速＼成本較高、靈敏度和專一性不高；無法定量檢測＼半致死量和致死量來衡量＼細胞毒素檢測＼可獲得高靈敏度、建立的細胞系可方便實驗＼工作量大＼10～20ng/mL＼HPLC＼對不同毒素可進行精確的定性和定量＼靈敏度較低、毒素需預(yù)處理、技術(shù)含量高，

價格昂貴＼1ng/mL＼GC-MS＼快速、準確、靈敏度高，可以測定不同的MC的異構(gòu)體＼技術(shù)含量高、操作復(fù)雜、需要標準毒素、

前處理過程復(fù)雜＼1ng/mL＼ELISA＼可檢測到毒素的不同同系物，操作方便，靈敏度高＼對多種同系物的識別需要廣譜抗體＼0.20ng/mL＼PPIA＼反映各種毒素的總量，檢測靈敏度高而且測定時間

較短、干擾較小，靈敏度更高＼不能區(qū)分特異性的同系物、需要新制備的

放射性底物、放射性廢物的處理困難＼2.5ng/mL＼]

目前，MCs檢測技術(shù)種類繁多，各種分析檢測方法都有其優(yōu)缺點和應(yīng)用范圍（表1）。為了適應(yīng)我國水質(zhì)監(jiān)測和環(huán)境保護工作的現(xiàn)狀要求，水體中MCs檢測方法應(yīng)朝著快速準確、操作簡單、攜帶便利、成本較低的方向發(fā)展。同時，建立成熟、高效的MCs提取、分離、純化、制備的方法是提高檢測準確性和經(jīng)濟性的必然趨勢。

參考文獻

[1]韓志國，武寶玗，張冬鵬，等.淡水水體中微囊藻毒素的監(jiān)測技術(shù)[J].中國環(huán)境監(jiān)測，2001，17（6）：35-39.

[2]錢蕓，戴樹桂，劉廣良.富營養(yǎng)化淡水水體微囊藻毒素的研究進展[J].環(huán)境污染技術(shù)與設(shè)備，2002，8（3）：13-17.

[3]徐均康，王紅兵，朱惠剛，等.藍藻毒素及其檢測方法的研究進展[J].上海環(huán)境科學，1996，15（9）：38-40.

[4]謝秀紅，谷康定.水環(huán)境中微囊藻毒素檢測技術(shù)研究進展[J].環(huán)境與健康雜志，2008，25（4）：370-372.

[5]梁麗麗，弓愛君，曹艷秋，等.水體中微囊藻毒素的檢測方法研究進展[J].化學與生物工程，2009，26（12）：12-15.

[6]俞順章，趙寧，資曉林，等.飲水中微囊藻毒素與我國原發(fā)性肝癌關(guān)系的研究[J].中華腫瘤雜志，2001，23（2）：96-99.

[7]劉碧波，肖邦定，劉劍彤，等.天然水體中痕量微囊藻毒素的高效液相色譜測定方法優(yōu)化[J].分析化學，2005，11（33）：1 577-1 579.

[8]聶晶晶，李元，李琴，等.微囊藻毒素檢測方法的研究進展[J].中國環(huán)境檢測，2007，23（2）：43-48.

[9]王春雨.微囊藻毒素對鴨的急性和亞慢性毒性研究[D].新鄉(xiāng)：河南師范大學，2010.

[10]施瑋，朱惠剛，晏曉蓉，等.微囊藻毒素MC-LR對原代肝細胞的影響[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學，2002，19（3）：129-131.

[11]谷康定，林群馨.微囊藻毒素-LR對傳代細胞的毒性[J].中國公共衛(wèi)生，2004，20（4）：411-412.

[12]楊翠云，李敦海，劉永定.微囊藻毒素對典型微生物生長及生理生化特性的影響[J].水生生物學報，2008，32（6）：818-823.

[13]潘林.飲用水中藻毒素檢測技術(shù)研究進展[J].四川環(huán)境，2009，28（5）：67-70.

[14]吳偉文，楊左軍，顧浩飛，等.固豐甘微萃彩高教液相色譜法測定水中的微囊藻毒素[J].分析測試學報，2007，26（4）：545-547.

（下轉(zhuǎn)34頁）

（上接21頁）[15]薛罡，楊林，龔清杰，等.高效液相色譜法測定水中微囊藻毒素[J].中國給水排水，2009，25（22）：90-97.

[16]梁麗麗，弓愛君，李紅梅，等.高效液相色譜法檢測水體中微囊藻毒素[J].分析化學，2010，38（5）：740-742.

[17]張立將，尹立紅，浦躍樸，等.水中微囊藻毒素高效液相色譜檢測與前處理條件優(yōu)化[J].東南大學學報：自然科學版，2005，35（3）：446-451.

[18]Carmela Dell Aversano，Geoffrey K Eaglesham，Michael A Quilliam. Analysis of cyanobaeterial toxins by hydruphilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2004，1 028：155-164.

[19]王蕾，李小艷，張惠，等.高效液相色譜-質(zhì)譜法測定藍藻中的微囊藻毒素[J].食品工業(yè)科技，2007，28（3）：197-199.

[20]Cong Liming，Huang Baifen. Determination of trace amount of microcystins in water samples using liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta，2006，569 （1-2）：155-164.

[21]Sano T，Nohara K，Shirai F，et al. A method for microdetection of total microcystin content in waterbloom of cyanobacteria（blue-green algae）[J]. Analytica Chimica Acta，1992，49：163-170.

[22]Kunimitsu Kaya，Tomoharu Sano. Total microcystin determination using erythro-2-methy1-3-（methoxy-d3）-4-phenylbutyric acid（MMPB-d3） as the internal standard[J]. Analytica Chimica Acta，1999，386：107-112.

[23]樊潔，肖邦定一，鄧南圣.微囊藻毒素的2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸檢測方法的研究[J].分析科學學報，2006，22（4）：377-380.

[24]Chu F S，Huang X，Wei R O. Enzyme-linked immunosorbent assay for microcystins in blue-green algal blooms.[J]. Analytica Chimica Acta，1990，73（3）：451-456.

[25]蔡正森，王海勇，孫蔚蓉，等. ELISA法與HPLC法檢測太湖水中藻毒素的比較研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006，16（8）：925-930.

[26] Wei Tao，F(xiàn)eng Xiaogang. Determination of Trace Level Microcystins in Water[J]. Research of Environmental Sciences.2005，18（5）：15-17.

[27]王亞，尹立紅，浦躍樸，等.應(yīng)用熒光蛋白磷酸酶抑制法檢測水中微囊藻毒素[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學，2006，33（5）：681-683.

（責編：張宏民）