乳酸乳球菌N3816發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

摘 要：以乳酸乳球菌株（Lactococcus lactis subsp. lactis N3816）為出發(fā)菌株，通過單因子試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)方法對(duì)該菌株產(chǎn)Nisin發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：該菌株產(chǎn)Nisin的最適碳源、復(fù)合氮源和生長(zhǎng)因子分別為：蔗糖0.8%、蛋白胨2.0%、酵母膏1.0%、Tween80 1.5%。

關(guān)鍵詞：乳鏈球菌肽；培養(yǎng)基；效價(jià)

中圖分類號(hào) TS207 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）19-34-03

乳鏈球菌肽（Nisin）是乳酸乳球菌的某些菌株在代謝過程中合成的一種具有較強(qiáng)抑菌作用的多肽類細(xì)菌素。成熟的乳鏈球菌肽分子含有34個(gè)氨基酸殘基，分子量約為3 510 Da，分子式為C143H228N42O37S7。乳鏈球菌肽前分子含有57個(gè)氨基酸，前體分子依次經(jīng)過將部分絲氨酸和蘇氨酸酶促轉(zhuǎn)化為脫水氨基酸、鏈內(nèi)形成5個(gè)硫醚環(huán)、細(xì)胞質(zhì)膜移位和斷裂去除N端23肽而形成[1-3]。

Nisin對(duì)引起食品腐敗的絕大部分革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，特別是對(duì)產(chǎn)芽孢的細(xì)菌如芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑制作用。另外，Nisin與某些表面活性劑、螯合劑和絡(luò)合劑聯(lián)合使用時(shí)還能抑制部分革蘭氏陰性菌。因此，與其它乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素相比，Nisin具有較寬的抑菌譜。Nisin屬于天然食品防腐劑的一種，自1951年首次應(yīng)用于食品保藏以來(lái)，Nisin已先后被數(shù)10個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛使用。目前，Nisin應(yīng)用于乳制品、肉制品、罐裝食品和蛋白食品等的防腐保鮮中，成為越來(lái)越受人們重視的一種安全、高效、無(wú)毒、天然的食品防腐劑[4]。

隨著Nisin在食品行業(yè)中應(yīng)用的普及，獲得產(chǎn)量較高且生產(chǎn)成本較低的Nisin成為工業(yè)化應(yīng)用的前提。為了提高其產(chǎn)量，人們開始研究一些發(fā)酵工藝因素對(duì)Nisin發(fā)酵生產(chǎn)的影響。本文主要是在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)乳酸乳球菌N 3816進(jìn)行研究，通過改變碳源、氮源和添加吐溫的方式獲得發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配比。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 Nisin標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于sigma公司。

1.2 菌種 乳鏈菌肽生產(chǎn)菌：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. lactis N 3816），由實(shí)驗(yàn)室保藏。效價(jià)檢測(cè)指示菌：藤黃微球菌（Micrococcus luteus），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0g、酵母膏0.3g、葡萄糖0.5g、牛肉膏0.3g、MgSO4·7H2O 0.02g、K2HPO4·3H2O 0.3g、pH6.8，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、蔗糖1.0g、K2HPO4 1.0g、NaCl 0.2、MgSO4·7H2O 0.02g、pH 7.0，121℃滅菌20min。

檢測(cè)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.8g、酵母膏0.5g、葡萄糖0.5g、NaCl 0.5g、Na2HPO4·12H2O 1.0g、pH 6.8，121℃滅菌20min。

檢測(cè)效價(jià)培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.8g、酵母膏0.5g、葡萄糖0.5g、NaCl 0.5g、Na2HPO4·12H2O 1.0g、Tween80 1.0mL、瓊脂1.5g、pH 7.0，121℃滅菌20min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵培養(yǎng) 將活化的斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中改變發(fā)酵培養(yǎng)基配方，測(cè)定發(fā)酵液效價(jià)。

1.4.2 Nisin標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 將Nisin標(biāo)準(zhǔn)樣品（效價(jià)

1×106IU/mL）用濃度為0.02mol/L無(wú)菌稀鹽酸溶液溶解，配制成濃度為1 000IU/mL的Nisin標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時(shí)用0.02mol/L無(wú)菌稀鹽酸溶液稀釋成10IU/mL，25IU/mL，50IU/mL，75IU/mL，100IU/mL，250IU/mL，500IU/mL，1 000IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.4.3 Nisin效價(jià)測(cè)定 效價(jià)檢測(cè)采用瓊脂孔擴(kuò)散法[5]。

1.4.4 單因子試驗(yàn) 碳源種類和濃度優(yōu)化試驗(yàn)：改變發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的種類進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定效價(jià)來(lái)確定最適碳源類型；改變最適合碳源濃度進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過測(cè)定效價(jià)來(lái)確定最適合濃度。

氮源種類與濃度的優(yōu)化試驗(yàn)：改變發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的種類進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定效價(jià)來(lái)確定最適氮源類型；改變最適合氮源濃度進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過測(cè)定效價(jià)來(lái)確定最適合濃度。

Tween80對(duì)產(chǎn)Nisin的影響：選取Tween80濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%，按上述方法確定適宜的濃度。

1.4.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)蔗糖、蛋白胨、酵母膏和Tween80用量4個(gè)因素，各取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化乳酸乳球菌N 3816產(chǎn)Nisin的培養(yǎng)基組成。試驗(yàn)因子及水平見表l。

由圖2可知，蔗糖濃度過大或過小對(duì)Nisin發(fā)酵都是不利的，蔗糖濃度在1.0%時(shí)對(duì)菌體合成Nisin效果最好，為

1 025IU/mL。當(dāng)蔗糖濃度>1.0%時(shí)，菌體合成Nisin有下降趨勢(shì)，并且濃度越高下降趨勢(shì)越明顯。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)楦邼舛鹊孜飳?dǎo)致滲透壓過高，抑制或影響了菌體的正常生長(zhǎng)使得Nisin效價(jià)受到影響而明顯下降[7]。

2.2 氮源對(duì)Nisin發(fā)酵的影響 以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，改變發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的種類，各種氮源的添加量都為1%，考察不同氮源對(duì)發(fā)酵的影響。發(fā)酵培養(yǎng)24h后測(cè)效價(jià)，結(jié)果見圖3。

由圖3可見，當(dāng)?shù)礊橛袡C(jī)氮源時(shí)，乳酸乳球菌N3816的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，復(fù)合氮源的發(fā)酵效果最好。復(fù)合氮源能為菌體生長(zhǎng)和Nisin合成提供一個(gè)較為合理的有機(jī)氮源配比，有利于微生物的生長(zhǎng)與合成代謝；同時(shí)，多種氮源復(fù)配有利于降低培養(yǎng)基成本，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)也十分有益。

2.3 Tween80對(duì)Nisin發(fā)酵的影響 以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，向起始發(fā)酵液中分別加入0%、0.50%、1.00%和1.50%（v/v）的Tween80，發(fā)酵培養(yǎng)24h后測(cè)效價(jià)，結(jié)果見圖4。 （下轉(zhuǎn)87頁(yè)）

圖4為不同Tween80添加量對(duì)乳酸乳球菌N3816發(fā)酵過程中Nisin產(chǎn)量的影響。由圖4可知，各濃度的Tween80對(duì)Nisin的合成都有促進(jìn)作用，并且Tween80的濃度越大Nisin產(chǎn)量提高越多。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Tween80對(duì)Nisin合成的促進(jìn)作用主要是通過降低菌種與培養(yǎng)基的表面張力，增加了細(xì)胞胞外酶的合成；同時(shí)，改善了細(xì)胞的膜透性，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和Nisin在胞內(nèi)的合成。另外也有研究專家學(xué)者認(rèn)為，Tween80的影響是由于其減慢了Nisin失活速率[8-9]。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 采用正交試驗(yàn)，對(duì)乳酸乳球菌N3816產(chǎn)Nisin的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

本研究表明Nisin的生物合成的最佳碳源是蔗糖，胰蛋白胨和酵母膏為其最佳有機(jī)氮源組合。經(jīng)過正交試驗(yàn)方法優(yōu)化得出乳酸乳球菌N3816發(fā)酵產(chǎn)Nisin的最佳發(fā)酵條件：蔗糖0.8%、蛋白胨2.0%、酵母膏1.0%、吐溫1.5%。在優(yōu)化條件下經(jīng)3批發(fā)酵培養(yǎng)Nisin的效價(jià)最高可達(dá)3 580IU/mL。

參考文獻(xiàn)

[1]吳瓊，李晶，黃海燕.乳酸鏈球菌與化學(xué)防腐劑抑菌效果比較[J].食品研究與開發(fā)，1999，20（1）：44-46.

[2]郭本恒.Nisin產(chǎn)品及影響產(chǎn)品活性的因素[J].中圍畜產(chǎn)與食品，2000，7（6）：263-265.

[3]吳兆亮，宮立鵬，趙艷麗，等.乳鏈菌肽發(fā)酵工藝的研究[J].化學(xué)反應(yīng)工程與工藝，2006，22（4）： 377-380.

[4]王立國(guó).乳酸鏈球菌素（Nisin）在食品中的應(yīng)用 [J].食品研究與開發(fā)，2008，29（10）：177-180.

[5]吳瓊.乳鏈菌肽效價(jià)測(cè)定方法的研究[J].食品科學(xué)，1999，5（6）：56-59.

[6]莊緒亮，張洪勛，馬桂榮，等.乳酸菌肽發(fā)酵的主要影響因子[J].化工冶金，2000，21（1）：93-97.

[7]盧金珍，趙為，任俊.乳鏈菌肽（Nisin）發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2010，4（5）：122-126.

[8]Degnan A J，Buyong N，Luchansky J B. Antilisterial activity of pediocin AcH in model food systems in the presence of an emulsifier or encapsulated within liposomes[J].Int J Food Microbiol，1993，18（2）： 127-138.

[9]Bhatti M，Veeramachaneni A，Shelef L A. Factors affecting the antilisterial effects of nisin in milk[J]. Int J Food Microbiol，2004，97（2）： 215-219.

（責(zé)編：施婷婷）