棕色棉發(fā)育期兒茶素的HPLC分析

摘 要：以棕色棉和白色棉為材料，利用HPLC法測(cè)定發(fā)育期種皮與纖維中兒茶素的組分與變化規(guī)律。結(jié)果表明：棉鈴發(fā)育期，深棕ANL-1和泗棉3號(hào)種皮中有兒茶素單體EGC、C、EC，纖維中有GC、C。深棕ANL-1種皮中主要組分C的含量高于泗棉3號(hào)，且在28～35DPA階段迅速下降。深棕ANL-1纖維中GC和C的含量均表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。泗棉3號(hào)發(fā)育期纖維中各兒茶素組分含量水平非常低。初步推斷在纖維伸長(zhǎng)期，兒茶素等棕色素前體不斷合成并積累，并在次生壁沉積期被逐漸氧化消耗而形成有色的棕色素。

關(guān)鍵詞：棉花；高效液相色譜法；兒茶素；縮合單寧

中圖分類(lèi)號(hào) S562 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）19-21-03

詹少華[1]利用純化色素進(jìn)行化學(xué)性質(zhì)鑒定、波譜測(cè)定以及生理學(xué)指標(biāo)分析，推斷天然棕色棉纖維色素為單寧類(lèi)氧化而來(lái)的醌類(lèi)化合物，并根據(jù)前人生物合成途徑的研究成果，總結(jié)和推斷縮合單寧是通過(guò)莽草酸途徑合成的兒茶素的聚合體。Ryser[2]通過(guò)薄層層析等試驗(yàn)方法，在棕色棉短絨里發(fā)現(xiàn)了單寧的前體兒茶素及單寧的衍生物，同時(shí)推測(cè)棕色纖維的顏色可能與位于液泡里的由兒茶素衍化的單寧作用有關(guān)，這正好驗(yàn)證了詹少華[1]的工作。但棕色棉與白色棉種皮與纖維發(fā)育期兒茶素單體成分及含量的變化規(guī)律如何，兒茶素與棕色素合成關(guān)系等報(bào)道較少。對(duì)于這些方面的研究將有助于我們進(jìn)一步了解棕色棉纖維色素的合成機(jī)理。

筆者通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）定性和定量測(cè)定了棕色棉和白色棉發(fā)育期種皮和纖維中兒茶素單體成分及含量變化，比較不同棉種中縮合單寧前體兒茶素的差異，以期為深入探討棕色棉色素的合成機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 以安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物物理實(shí)驗(yàn)室選育的品系深棕色棉“ANL-1”和白色棉“泗棉3號(hào)”為實(shí)驗(yàn)材料，于2012年5月種植于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)園區(qū)內(nèi)，常規(guī)管理，開(kāi)花期選擇發(fā)育正常、無(wú)病蟲(chóng)害植株的中上部果枝，上午9∶00～11∶00對(duì)當(dāng)日花進(jìn)行掛牌，每隔7d取棉鈴，-70℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兒茶素的提取 采用乙醇提取法[3]，分別取0.8g種皮與纖維，加少許石英砂和3mL 95%的乙醇研磨至勻漿狀，5 000rpm離心10min，吸取上清，沉淀加3mL 95%的乙醇，再次離心。此法重復(fù)3次，最后95%的乙醇定容至10mL。加2倍體積水后，2倍體積乙酸乙酯萃取2次兒茶素。收集乙酸乙酯并在70℃左右減壓干燥，得兒茶素粗品。色譜甲醇溶解并定容至1mL，稀釋2倍，過(guò)有機(jī)濾頭，進(jìn)樣。

1.2.2 兒茶素的HPLC分析及含量計(jì)算 幾種兒茶素的組分采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：色譜泵：Waters 600；控制儀：Waters 600；色譜柱：Phenomenex Synergi 4u Fusion 250×4.6mm；檢測(cè)器：UV Waters 2487；靈敏度：0.01；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；流速：1.2mL/min；進(jìn)樣量：5μL；每一試樣進(jìn)樣之前，以流動(dòng)相平衡15min。采用梯度洗脫條件A相：1%乙酸，B相：色譜純乙腈，保留時(shí)間40min。洗脫具體條件見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素的HPLC檢測(cè)分析 分別取28DPA時(shí)的深棕ANL-1的種皮與纖維，以泗棉3號(hào)為對(duì)照，HPLC定性檢測(cè)其中兒茶素單體成分，檢測(cè)結(jié)果如圖1～4所示，以標(biāo)樣色譜（圖5）為參照：深棕ANL-1種皮中檢測(cè)出EGC、C、EC，出峰時(shí)間分別在7.794min、9.22min、13.359min，峰面積為3 546、522 704、18 567。泗棉3號(hào)種皮中檢測(cè)出EGC、C、EC，出峰時(shí)間分別在7.864min、9.305min、13.470min，峰面積為20 643、440 708、15 104。深棕ANL-1纖維中檢測(cè)出GC、C，出峰時(shí)間在5.367min和9.272min，峰面積分別為20 316和19 449。泗棉3號(hào)纖維中檢測(cè)出GC、C，出峰時(shí)間為5.395min和9.230min，峰面積為6 409和54 944。其他兒茶素單體成分難以檢測(cè)到。故初步推斷深棕ANL-1和泗棉3號(hào)種皮發(fā)育期兒茶素單體成分為EGC、C、EC，其纖維發(fā)育期兒茶素單體成分為GC和C。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)高效液相色譜的檢測(cè)，分別發(fā)現(xiàn)了在棕色棉和白色棉發(fā)育期的種皮與纖維中存在著不同組分的兒茶素。這恰好與Ryser[2]的研究結(jié)果吻合，并進(jìn)一步驗(yàn)證了詹少華[1]的工作。深棕ANL-1種皮中主要組分C的含量高于泗棉3號(hào)，且在28～35DPA階段迅速下降，這與其所對(duì)應(yīng)的縮合單寧含量的變化規(guī)律相似，說(shuō)明在該時(shí)期兒茶素衍化成縮合單寧，并被消耗氧化形成醌類(lèi)物質(zhì)。同時(shí)，泗棉3號(hào)發(fā)育期纖維中各兒茶素組分含量水平非常低，表明白色棉發(fā)育期纖維中兒茶素聚合形成的縮合單寧含量少，棕色素前體合成少。深棕ANL-1纖維中GC和C的含量均表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，初步推斷在纖維伸長(zhǎng)期（0～25DPA），由兒茶素衍化生成的單寧類(lèi)物質(zhì)等棕色素前體不斷合成并積累，并在次生壁沉積期（25～45DPA）被逐漸氧化消耗而形成有色的棕色素。

參考文獻(xiàn)

[1]詹少華，林毅，蔡永萍，等. 縮合單寧與天然棕色棉纖維色素合成的關(guān)系[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2007，9（3）： 183-188.

[2]Ryser U. Cell wall growth in elongating cotton fibers： an autoradiographic study[J]. Cytobiology，1980，15： 78-84.

[3]Kitakawa N S，Takeishi J，Yonemoto T. Improvement of Catechin Productivity in Suspension Cultures of Tea Callus Cells[J]. Biotechnol.Prog. 2003，19： 655-658.

[4]董合忠，李維江，唐薇，等. 彩色棉纖維發(fā)育與色素形成[J]. 中國(guó)棉花，2004，31（2）： 2-4.

[5]胡超，楊園園，郭寧，等. 棕色棉和白色棉縮合單寧單體兒茶素動(dòng)態(tài)變化比較[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2011，47 （7）： 685-690.

（責(zé)編：徐世紅）