綠色木霉外源基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

摘要：利用PCR方法克隆瑞氏木霉（Trichoderma reesei）外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ基因（cbhⅠ）啟動(dòng)子序列，以pSK載體為骨架，構(gòu)建了pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)入到綠色木霉（T. viride）Sn-9106中。通過(guò)對(duì)綠色木霉Sn-9106進(jìn)行遺傳改造，為纖維素酶基因在木霉中同源重組表達(dá)提供遺傳轉(zhuǎn)化平臺(tái)。

關(guān)鍵詞：綠色木霉（Trichoderma viride）；cbhⅠ啟動(dòng)子；綠色熒光蛋白；外源基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q786；Q939.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）13-3180-03

纖維素酶在木質(zhì)纖維素資源化利用過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。目前纖維素酶存在酶活性低、對(duì)天然木質(zhì)纖維素分解能力弱、生產(chǎn)周期長(zhǎng)以及價(jià)格昂貴等問(wèn)題，嚴(yán)重制約了其工業(yè)化應(yīng)用[1，2]。本實(shí)驗(yàn)室選育的綠色木霉（Trichoderma viride）Sn-9106能以秸稈、紙漿等工業(yè)廢物為碳源，將其中的纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖成分，是一株適合固體發(fā)酵模式的纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)菌株[3-5]。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，利用分子生物學(xué)手段研究絲狀真菌纖維素酶系分泌機(jī)制、活性及協(xié)同作用等逐漸成為目前研究熱點(diǎn)[6-8]。研究表明，纖維素酶在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中容易形成包涵體、酶活性比較低、缺乏糖基化修飾；在酵母中表達(dá)又存在著過(guò)度糖基化和蛋白折疊等問(wèn)題，使表達(dá)的纖維素酶活性嚴(yán)重喪失[9]。目前木霉為適合真菌類纖維素酶的表達(dá)載體之一[10]。瑞氏木霉（Trichoderma reesei）中外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ基因（cbhⅠ）是纖維素酶基礎(chǔ)性表達(dá)基因之一。在異源表達(dá)過(guò)程中，cbhⅠ啟動(dòng)子在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在的情況下也能夠啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)[1]。本研究利用瑞氏木霉cbhⅠ啟動(dòng)子、以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因、潮霉素為抗性標(biāo)記構(gòu)建綠色木霉表達(dá)載體，為構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 瑞氏木霉QM9414、綠色木霉Sn-9106、pET30-GFP質(zhì)粒和pSK質(zhì)粒載體由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院保存；pSM565質(zhì)粒由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心提供；感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5α購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；pMD19-T Simple Vector購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 Taq DNA聚合酶、Long Taq DNA聚合酶等PCR試劑，質(zhì)粒小量提取試劑盒，DNA Marker，潮霉素，IPTG，X-Gal均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 cbhⅠ啟動(dòng)子、GFP基因、hph基因的克隆 根據(jù)GenBank NCBI上瑞氏木霉cbhⅠ啟動(dòng)子、GFP基因及hph基因序列設(shè)計(jì)引物如表1。提取瑞氏木霉基因組DNA[11]，并以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增克隆出cbhⅠ啟動(dòng)子。cbhⅠ啟動(dòng)子用二步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s ，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，67 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。分別以pET30-GFP和 pSM565質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出GFP基因、hph基因。GFP基因PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。hph基因PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物回收后，與pMD 19-T Simple Vector連接，并送寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。

1.2.2 cbhⅠ啟動(dòng)子表達(dá)載體pSK-cbhⅠ的構(gòu)建 將pMD 19-T-cbhⅠ用SacⅠ和EcoRⅠ雙酶切，然后與經(jīng)同樣酶切的pSK載體連接，得到重組質(zhì)粒pSK-cbhⅠ，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上隨機(jī)選取白色轉(zhuǎn)化子，小量提取制備轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒用于酶切鑒定。

1.2.3 表達(dá)載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph的構(gòu)建 將pMD 19-T-GFP用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切，與同樣雙酶切的重組質(zhì)粒pSK-cbhⅠ連接，得重組質(zhì)粒后，再以同樣的方法將pMD 19-T-hph進(jìn)行酶切和連接，構(gòu)建表達(dá)載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph。

1.2.4 綠色木霉表達(dá)載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph的轉(zhuǎn)化 綠色木霉Sn-9106原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[12]。將適量轉(zhuǎn)化液涂布于再生培養(yǎng)基， 28 ℃培養(yǎng)12～16 h；在再生培養(yǎng)基上添加一層含75 μg/mL潮霉素的半固體絲狀真菌MM培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3～4 d；挑選潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子，接種于PDA斜面培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d；挑取斜面培養(yǎng)基上的綠色木霉制成水壓片，在熒光顯微鏡下觀察菌絲，選取有熒光的綠色木霉接種于MM液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 d；利用PCR方法檢測(cè)GFP基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 cbhⅠ啟動(dòng)子、GFP基因和hph基因的克隆

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1-圖3）。PCR產(chǎn)物電泳條帶清晰完整，cbhⅠ啟動(dòng)子大小約為1 500 bp，GFP基因大小為726 bp，hph基因大小為1 026 bp，均與預(yù)期大小相符。測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì)分析同源性分別達(dá)到96%、90%和92%。

2.2 綠色木霉表達(dá)載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph的構(gòu)建

將pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，在氨芐培養(yǎng)基上隨機(jī)選取白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切鑒定見(jiàn)圖4。酶切產(chǎn)物大小與cbhⅠ啟動(dòng)子、GFP基因、hph基因片段大小相符。綠色木霉表達(dá)載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph圖譜如圖5所示。

2.3 pSK-cbhⅠ-GFP-hph轉(zhuǎn)化綠色木霉Sn-9106

將pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達(dá)載體轉(zhuǎn)化綠色木霉Sn-9106原生質(zhì)體中，在含75 μg/mL潮霉素的培養(yǎng)皿上得到16個(gè)抗性轉(zhuǎn)化子，利用表1中3對(duì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果（圖6）。由圖6可知，cbhⅠ啟動(dòng)子、hph基因及GFP基因均已轉(zhuǎn)化到綠色木霉中。將轉(zhuǎn)化子單菌落經(jīng)PDA培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，制成水壓片，在熒光顯微鏡下可觀察到含有綠色熒光的菌絲（圖7）。

3 小結(jié)

本研究利用pSK載體為骨架，構(gòu)建了帶有cbhⅠ啟動(dòng)子的pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達(dá)載體，在熒光顯微鏡下觀察到含有綠色熒光的菌絲，證實(shí)綠色木霉外源基因表達(dá)載體構(gòu)建成功。雖然驗(yàn)證了綠色熒光蛋白的表達(dá)，但對(duì)于cbhⅠ啟動(dòng)子是否對(duì)外源基因啟動(dòng)了高效表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。絲狀真菌纖維素酶表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的酶為混合酶系，給分離純化目的蛋白造成很大的障礙，而且絲狀真菌纖維素酶啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型，所以在利用絲狀真菌作為纖維素酶表達(dá)宿主時(shí)，通常構(gòu)建組成型表達(dá)載體。另外也有文獻(xiàn)報(bào)道，以絲狀真菌啟動(dòng)子構(gòu)建載體表達(dá)外源蛋白，須在外源蛋白基因前加入信號(hào)肽。因此，下一步對(duì)瑞氏木霉cbhⅠ啟動(dòng)子的作用機(jī)制進(jìn)行研究，并應(yīng)用于對(duì)綠色木霉纖維素酶基因的改造。

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