稀土離子（La3+、Ce3+、Nd3+）對超氧化物歧化酶活性的影響

摘要：利用微量鄰苯三酚自氧化法（320 nm）研究了25 ℃下，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖體系中（pH 8.2）不同稀土離子（La3+、Ce3+、Nd3+）對鄰苯三酚自氧化和銅鋅超氧化物歧化酶（Cu， Zn-SOD）活性的影響，并對可能的抑制作用機理進行了討論。結(jié)果表明，稀土離子La3+、Nd3+對鄰苯三酚自氧化有抑制作用，Ce3+對鄰苯三酚自氧化表現(xiàn)出先抑制后促進的作用；3種稀土離子對Cu，Zn-SOD酶活性均存在抑制作用，并隨稀土離子濃度的增加抑制程度不斷增強，而當(dāng)加入的稀土離子濃度大于2.22×10-5 mol/L時，Cu，Zn-SOD完全失活。

關(guān)鍵詞：銅鋅超氧化物歧化酶；稀土離子；鄰苯三酚；活性

中圖分類號：O614.33；Q55 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3145-05

銅鋅超氧化物歧化酶（Cu，Zn-SOD）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基（·O2-）發(fā)生歧化反應(yīng)，清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基[1]，具有抗衰老、抗癌、防白內(nèi)障等作用，在生命體的自我保護系統(tǒng)中起著極為重要的作用[2]。

稀土元素有“農(nóng)業(yè)維生素”之稱，自20世紀(jì)80年代以來，稀土作為微量元素肥料已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。大量研究表明，稀土對提高作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)都起到了積極作用[3，4]。關(guān)于稀土元素對生物體內(nèi)超氧化物歧化酶活性的影響研究廣泛，有報道認為，稀土元素對提高植物的超氧化物歧化酶活性以及降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的含量有十分重要的作用[5]；另有報道認為稀土離子對生物體內(nèi)超氧化物歧化酶活性影響不大[6]。因此，弄清稀土元素與超氧化物歧化酶的相互作用，將直接證明稀土元素對生物體的保護及刺激作用，從而明確稀土元素對提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)的機理，并有希望將稀土化合物開發(fā)為清除超氧陰離子自由基的藥物。

本研究利用鄰苯三酚在堿性條件下自氧化生成超氧陰離子自由基的性質(zhì)，來分析和探討稀土離子和超氧化物歧化酶在純化學(xué)條件下的相互作用。鄰苯三酚在堿性條件下可發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成超氧陰離子自由基，并受抗氧化酶的抑制，盡管與生物體內(nèi)的生化反應(yīng)尚有很大差別，但可為明確稀土在生物內(nèi)對抗氧化酶的作用機制提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 SP-1920UV系列雙光束紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司），pHS-3E型數(shù)字酸度計（上海雷磁分析儀器有限公司），BSA124S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司），SYP-Ⅱ型恒溫水槽（南京桑力電子設(shè)備有限公司）。

1.1.2 試劑 牛血Cu， Zn-SOD（3 000 U/mg，F(xiàn)luka），三羥甲基氨基甲烷（>99.9%，上海源聚生物科技有限公司），鹽酸（開封東大化工有限公司），鄰苯三酚（貴州遵義佳宏化工有限責(zé)任公司），氯化鑭、氯化亞鈰、氯化釹（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），除標(biāo)注外其他試劑均為分析純試劑，水為二次蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 鄰苯三酚自氧化測定 準(zhǔn)確量取4.50 mL濃度為 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2） 和4.20 mL蒸餾水，混勻后立即加入在25 ℃下恒溫20 min的2.5 mmol/L鄰苯三酚0.30 mL（對照管用0.01 mol/L的鹽酸溶液代替），立即混勻，迅速倒入比色池中，在波長為320 nm下采用紫外可見分光法對鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物進行掃描，掃描間隔為1 s，記錄該掃描曲線初始階段斜率即為鄰苯三酚的自氧化速率△A/min，每次試驗均重復(fù)3次。

1.2.2 稀土離子對鄰苯三酚自氧化的影響 測定稀土離子對鄰苯三酚影響時同“1.2.1”，只是在加入鄰苯三酚前，分別先加入一定量的稀土離子，并減少同體積的二次蒸餾水的量，記錄在320 nm處吸光度（A）隨時間（t）的變化曲線，并求取曲線斜率。

1.2.3 鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性 超氧化物歧化酶活性測定法同“1.2.1”，加入鄰苯三酚前先加入一定量超氧化物歧化酶（4 μg/mL），并減少同體積二次蒸餾水，記錄該曲線的斜率。

1.2.4 稀土離子對超氧化物歧化酶活性的影響 測定稀土離子對超氧化物歧化酶活性的影響同“1.2.1”，在加入鄰苯三酚之前，先加一定量的超氧化物歧化酶和一定量的稀土離子，并減少同體積二次蒸餾水。記錄在320 nm處吸光度（A）隨時間（t）的變化曲線，并求取曲線斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄰苯三酚自氧化中最大吸收波長的確定

鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在特定波長處有靈敏吸收峰，但在具體應(yīng)用中，測定波長的選擇存在較大差異，主要有420 nm[7]和325 nm[8]兩種。為了準(zhǔn)確測定其最大吸收峰位置，對鄰苯三酚自氧化過程在不同時間進行了光譜掃描，掃描波長范圍為200～700 nm，其結(jié)果見圖1。鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在440 nm和320 nm處有吸收峰，與文獻報道的420 nm和325 nm并不相同。320 nm處在反應(yīng)初期即有較強吸收，并隨反應(yīng)進行該處的吸收強度不斷增強，在反應(yīng)30 min時峰強度有所降低，主要是由于自氧化進程在30 min時反應(yīng)已基本完成；而440 nm處直到10 min后才觀測到有明顯的峰出現(xiàn)，而且在整個掃描時間段，該處峰值比320 nm處的峰值要低?？紤]到測量的靈敏度，本試驗均選擇在波長為320 nm處進行測定。

2.2 鄰苯三酚的自氧化過程

在堿性條件下鄰苯三酚自氧化反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，該自由基進一步與中間產(chǎn)物反應(yīng)生成具有強吸收的醌，其在320 nm處有最大吸收。通過對鄰苯三酚自氧化過程進行時間掃描，得到了吸光度（A）隨時間（t）的變化曲線，如圖2所示。在反應(yīng)初期吸光度值隨時間變化呈一直線（線性相關(guān)系數(shù)可達0.999以上），直線范圍維持至5 min左右，此后斜率漸變平緩。為了準(zhǔn)確表示反應(yīng)初期鄰苯三酚的自氧化速率，以下每次試驗均選取前3 min內(nèi)直線斜率來表示鄰苯三酚的自氧化速率△A/min。

2.3 鄰苯三酚自氧化最佳濃度的確定

鄰苯三酚濃度可對其自氧化產(chǎn)物的濃度產(chǎn)生影響，從而影響吸收信號的強度。因此，固定其他條件不變，僅改變鄰苯三酚的濃度，測定其對自氧化速率的影響，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，鄰苯三酚自氧化速率與其濃度變化呈正比，線性方程為△A =-0.006 13+ 0.027 19 C（R2=0.999 09），從而說明鄰苯三酚自氧化具有一級反應(yīng)動力學(xué)特征，這與袁倬斌等[9]的觀點是一致的。另外，在鄰苯三酚濃度為2.5 mmol/L時其自氧化速率約為0.068，據(jù)張宏等[10]的報道，鄰苯三酚自氧化速率處于0.06～0.07之間時具有較高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，因此在以下試驗中均選用鄰苯三酚的濃度為2.5 mmol/L。

2.4 超氧化物歧化酶最佳加入量的確定

為了了解超氧化物歧化酶對鄰苯三酚自氧化速率的影響，固定鄰苯三酚的濃度為2.5 mmol/L，改變超氧化物歧化酶的加入量，測定超氧化物歧化酶的加入量對鄰苯三酚的氧化速率的影響，結(jié)果見圖4。鄰苯三酚自氧化速率隨酶量增加呈指數(shù)衰減，該現(xiàn)象可用鄰苯三酚法測定超氧化物歧化酶活性的原理[11]得到解釋。

在堿性條件下，鄰苯三酚可在羥基發(fā)生離解時與溶液中的溶解氧發(fā)生反應(yīng)生成半醌自由基，并產(chǎn)生·O2-；然后半醌自由基可進一步被·O2-氧化成具有強吸收的醌，如下式所示：

如果溶液中含有超氧化物歧化酶，則·O2-一經(jīng)產(chǎn)生即被超氧化物歧化酶歧化生成H2O2和O2，半醌自由基不能形成具有強吸收的醌，檢測到的吸收強度將比無超氧化物歧化酶時減弱，且減弱的程度與超氧化物歧化酶的濃度或活性有關(guān)，依據(jù)此原理可對超氧化物歧化酶的活性進行測定。因此，酶加入量越多，對鄰苯三酚的抑制就越強，自氧化速率就越小。據(jù)張宏等[10]的報道，最優(yōu)的加酶量應(yīng)為能抑制鄰苯三酚的自氧化下降50%為宜，此時測定的準(zhǔn)確度和靈敏度都會比較高。最終確定酶的加入量為0.50 mL。

2.5 不同種類稀土離子對鄰苯三酚自氧化速率的影響

為了考察稀土離子La3+、Ce3+、Nd3+對超氧化物歧化酶活性的影響，首先要弄清稀土離子對底物鄰苯三酚是否存在作用。因此，首先測定了3種稀土離子對鄰苯三酚自氧化速率的影響，結(jié)果見圖5。鄰苯三酚自氧化速率隨La3+和Nd3+濃度的增加而降低，而隨著Ce3+濃度的增加表現(xiàn)出先增加后減小的趨勢。結(jié)果表明，La3+和Nd3+對鄰苯三酚自氧化存在抑制作用。王春霞等[12]采用脈沖輻解法研究了不同稀土離子對超氧陰離子自由基的抑制作用，結(jié)果表明，稀土離子對超氧陰離子自由基有明顯的抑制作用，并隨著稀土離子濃度的增加而抑制程度增加，其中La3+和Nd3+相比，Nd3+的抑制效果要強于La3+，與本試驗結(jié)果是一致的。由于稀土離子對超氧陰離子自由基的抑制作用，使得鄰苯三酚自氧化中間產(chǎn)物阻斷，從而導(dǎo)致難以生成強吸收的醌，因此表現(xiàn)出自氧化速率降低。

而Ce3+對鄰苯三酚自氧化速率影響較為復(fù)雜，推測其原因可能是由于鈰離子是變價金屬，存在+3和+4價，而鄰苯三酚自氧化本身反應(yīng)機理就較為復(fù)雜[9]，存在著活性氧自由基的相互轉(zhuǎn)化，期間會涉及到電子的轉(zhuǎn)移過程，加入Ce3+后，Ce3+極有可能參與了這些反應(yīng)，使機理更加復(fù)雜。王金勝等[13]認為，低濃度的Ce3+可清除大量的·O2-，其反應(yīng)如下：

Ce3++·O2-+2H+→Ce4++H2O2，Ce4++·O2-→Ce3++O2

而其他兩種稀土離子因為僅存在+3穩(wěn)定價態(tài)，影響較為單一。關(guān)于稀土元素具有清除·O2-的作用，有報道解釋是由于稀土離子與過氧化物-自由基發(fā)生了加合作用，其中還包括鍵合作用，電子轉(zhuǎn)移和磁偶極-偶極相互作用等的結(jié)果[14]。

另外，從圖5可看出，La3+、Nd3+及Ce3+（在低濃度時）對鄰苯三酚自氧化速率均有抑制作用，這與超氧化物歧化酶對鄰苯三酚自氧化速率有抑制作用是相似的，但比較圖4與圖5，從鄰苯三酚自氧化速率的改變范圍可明顯看出，超氧化物歧化酶對鄰苯三酚自氧化的抑制作用明顯強于稀土離子對鄰苯三酚自氧化的抑制作用。

2.6 稀土離子對超氧化物歧化酶活性的影響

為了研究稀土離子和酶的相互作用，在固定其他條件不變的情況下，將超氧化物歧化酶和稀土離子作用1 h后再加入鄰苯三酚。圖6為超氧化物歧化酶與不同濃度稀土離子作用后對鄰苯三酚自氧化速率和影響曲線。由圖6可知，3種稀土離子與酶作用后對鄰苯三酚自氧化速率的影響情況基本相同，均隨稀土離子濃度的增加呈現(xiàn)先增加后基本不變的趨勢。比較圖5與圖 6，除Ce3+外，隨稀土離子濃度增加，鄰苯三酚自氧化速率的變化方向是相反的，說明稀土離子對超氧化物歧化酶是有作用的，因為在不加稀土離子時，酶對鄰苯三酚自氧化有抑制作用，而在不加酶時，稀土離子對鄰苯三酚自氧化也是抑制作用。但從圖 6可看出，在將酶與稀土作用一段時間后，鄰苯三酚的自氧化速率反而增加了（需要特別說明的是，盡管表觀上自氧化速率是增加了，但與不加稀土和酶時的自氧化速率0.068相比，仍均處于0.068下方，說明表觀的增加實際反映的是抑制程度的減弱），從而從側(cè)面說明在酶和稀土作用一段時間后，由于兩者之間的相互作用，導(dǎo)致酶的活性被稀土離子所抑制。在稀土離子濃度較低時，超氧化物歧化酶過量，隨著稀土離子濃度的增加，剩余超氧化物歧化酶的量不斷越少，從而對鄰苯三酚自氧化的抑制程度不斷降低，因此在圖6中表現(xiàn)為稀土離子濃度較小時，鄰苯三酚自氧化速率不斷增加；而伴隨稀土離子濃度的不斷增加，當(dāng)La3+、Ce3+、Nd3+的濃度大于2.22×10-5 mol/L時，超氧化物歧化酶被稀土離子完全抑制，此后再增加稀土離子時，稀土離子會過量，此時主要表現(xiàn)為多余的稀土離子對鄰苯三酚自氧化的影響，而該影響程度可從圖5中看出，3種稀土離子在濃度大于2.22×10-5 mol/L后，對鄰苯三酚的影響均較小，這與圖6中的結(jié)果恰好是一致的。

2.7 稀土離子對超氧化物歧化酶活性影響的相關(guān)性分析

稀土離子對超氧化物歧化酶有抑制作用，其可能原因可從Cu，Zn-SOD的分子結(jié)構(gòu)入手來探討。Cu，Zn-SOD分子由2個相同的亞基組成，每個亞基含有1個Cu2+和1個Zn2+，Cu2+由酶蛋白的4個組氨酸咪唑基的N原子和1個水分子配位，形成菱形對稱配位環(huán)境，Zn2+被包埋在蛋白質(zhì)的疏水集團中，主要起穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)的作用。Cu2+是酶的活性中心，周圍由帶正電荷的氨基酸包圍著，Cu2+活性中心通過電子傳遞催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，催化機理被描述如下[15]：

E-Cu（Ⅱ）+·O2-？葑E′-Cu（Ⅰ）+O2

E′-Cu（Ⅰ）+·O2-+2H+？葑E-Cu（Ⅱ）+H2O2

2·O2-+2H+？葑H2O2+O2

關(guān)于稀土離子對酶活性影響的研究表明，稀土離子對酶的抑制機理主要存在以下情況：一是稀土離子作用于酶的活性中心，稀土離子由于半徑與金屬酶活性中心離子半徑相當(dāng)從而替換出離子導(dǎo)致酶失活；二是稀土離子作用于酶活性中心的周圍環(huán)境，由于稀土離子具有空軌道，容易和酶蛋白的氨基酸殘基作用產(chǎn)生配合物，使部分酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失去活性。在本研究中，考慮到稀土離子Ce3+、La3+、Nd3+與Cu， Zn-SOD活性中心離子Cu2+、Zn2+半徑相差較大，較難替換酶中心離子而失活，因此推測3種稀土離子主要是由于第二種原因?qū)е铝嗣富钚缘母淖?。馮志祥等[6]采用ESR譜證實稀土離子Ce3+對Cu，Zn-SOD酶活性的影響主要是通過與活性中心附近的氨基酸的羧基作用而導(dǎo)致酶活性的改變，該結(jié)論也可從側(cè)面證明我們推測的可能性。

3 小結(jié)與討論

本研究采用鄰苯三酚自氧化法測定了不同稀土離子對鄰苯三酚自氧化和超氧化物歧化酶活性的影響。研究表明，在不加酶、只加稀土離子的情況下，隨著稀土離子La3+、Nd3+濃度的增加，鄰苯三酚自氧化速率不斷降低，說明La3+、Nd3+對鄰苯三酚自氧化中間物超氧陰離子自由基存在抑制作用，而隨著Ce3+濃度的增加，鄰苯三酚自氧化速率表現(xiàn)出先減后增的趨勢，推測可能與其為變價金屬，參與了自氧化進程有關(guān)。

另外，在加入稀土離子和超氧化物歧化酶的情況下，3種稀土離子都表現(xiàn)出了對超氧化物歧化酶活性的抑制作用，在加入稀土離子大于2.22×10-5 mol/L時，超氧化物歧化酶活性被完全抑制，表現(xiàn)為稀土離子與超氧化物歧化酶作用后，剩余的稀土離子與鄰苯三酚的作用。推測可能的抑制機理是由于稀土離子與超氧化物歧化酶活性中心外的氨基酸殘基作用導(dǎo)致酶失活。

參考文獻：

[1] 楊東升.超氧化物歧化酶的研究與應(yīng)用[J].化學(xué)與生物工程，2004（3）：7-9.

[2] NANDI A， CHATTERJEE I B. Assay of superoxide dismutase activity in animal tissues[J]. J Biosci，1988，13（3）：305-315.

[3] 徐建明，汪 鑫，樊趁英，等. 稀土鑭對水稻幼苗生長及葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，25（1）：117-122.

[4] 張險峰. 稀土鈰對低溫條件下黃瓜幼苗SOD、CAT酶活性的影響[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2008， 14（7）：89-90.

[5] PANG X， WANG D H， XING X Y， et al. Effect of La3+ on the activities of antioxidant enzymes in wheat seedings under lead stress in solution culture[J]. Chemosphere，2002（47）：1033-1039.

[6] 馮志祥，張樹功，劉啟民，等.稀土離子與牛血Cu（Zn）-SOD的作用[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，1995， 16（7）：993-996.

[7] 許申鴻，杭 瑚，李運平. 超氧化物歧化酶鄰苯三酚測活法的研究及改進[J]. 化學(xué)通報， 2001（8）：516-519.

[8] 鄧碧玉，袁勤生，李文杰.改良的鄰苯三酚自氧化測定超氧化物歧化酶活性的方法[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)進展，1991，18（2）：163.

[9] 袁倬斌，高若梅.鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的動力學(xué)研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，1997，18（9）：1438-1441.

[10] 張 宏，譚竹鈞. 四種鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性方法的比較[J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2002，33（6）：677-681.

[11] LI X C. Improved pyrogallol autoxidation method： A reliable and cheap superoxide-scavenging assay suitable for all antioxidants[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60：6418-6424.

[12] 王春霞，劉亞力，李鳳梅，等. 稀土硝酸鹽對生成超氧陰離子自由基的抑制作用[J]. 中國稀土學(xué)報，2000，18（3）：286-288.

[13] 王金勝，郭春絨，程玉香. 鈰離子清除超氧化物自由基的機理[J]. 中國稀土學(xué)報，1997，15（2）：151-154.

[14] 龐 欣，王東紅，彭 安.稀土離子對超氧陰離子自由基生成的抑制作用[J].環(huán)境化學(xué)，2001，20（6）：557-560.

[15] BODEN N， HOLMES M C， KNOWLES P F. Binding of water to “Types I and II”Cu2+ in proteins[J]. Biochim Biophys Res Commun，1974，57（3）：845-848.