虹彩病毒和柱狀黃桿菌混合感染大鯢的診治

摘要：2012年7月，貴州省某大鯢養(yǎng)殖場發(fā)生了以大鯢體表和四肢多處潰爛、內(nèi)臟器官出現(xiàn)充血、出血為特征的疾病，經(jīng)過臨床癥狀觀察、病理剖檢及實驗室診斷，診斷為虹彩病毒（Iridovirus）和柱狀黃桿菌（Flabobacterium columnare）的混合感染。通過采取綜合有效的防治措施，大鯢疫情得到有效控制。

關鍵詞：大鯢（Andrias davidianus）；虹彩病毒（Iridovirus）；柱狀黃桿菌（Flabobacterium columnare）；混合感染

中圖分類號：S947.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3102-03

大鯢（Andrias davidianus），俗稱娃娃魚，是我國特有的珍稀有尾兩棲動物，為國家二級保護動物，其經(jīng)濟價值高，具有廣泛開發(fā)利用的前景。近年來，人工養(yǎng)殖大鯢中不斷發(fā)生各種疾病，給養(yǎng)殖戶造成慘重的經(jīng)濟損失。2012年7月，貴州省某大鯢養(yǎng)殖場發(fā)生了以大鯢體表和四肢多處潰爛、內(nèi)臟器官出現(xiàn)充血、出血為特征的疾病，經(jīng)過臨床癥狀觀察、病理剖檢及實驗室診斷，診斷為虹彩病毒（Iridovirus）和柱狀黃桿菌（Flabobacterium columnare）的混合感染。通過采取有效的防治措施，大鯢疫情得到有效控制，現(xiàn)將診治情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 貴州省某大鯢養(yǎng)殖場發(fā)病大鯢，體重150～300 g，體長30.0～35.0 cm。

1.1.2 試劑 生化鑒定管和藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；Goldview、Tris、EDTA、DNA Marker、Taq DNA聚合酶及dNTPs等購自寶生物（大連）工程有限公司；TIANamp病毒基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；引物由寶生物（大連）工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀觀察及病理剖檢 觀察大鯢臨床癥狀并對病死大鯢進行病理解剖，觀察大鯢組織器官病變情況。

1.2.2 細菌生化鑒定與藥敏試驗 采用無菌操作剖取患病大鯢的肝臟組織，用接種環(huán)接種在普通瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察是否有細菌生長。若分離出細菌，將進行細菌的生化鑒定與藥敏特性的測定。藥敏試驗按常規(guī)藥敏紙片法測定頭孢噻吩、頭孢拉定、慶大霉素、氟哌酸、頭孢三嗪、強力霉素、頭孢唑啉、卡那霉素、四環(huán)素、青霉素、氨芐青霉素、紅霉素、潔霉素、多粘菌素B、痢特靈、復方新諾明、利福平、鏈霉素等抗菌素對分離菌株的抗藥譜，測定抑菌圈直徑。

1.2.3 16S rRNA基因序列分析 用TIANamp病毒基因組DNA提取試劑盒提取病死大鯢基因組DNA。采用細菌16S rRNA基因通用引物，16S rRNA-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S rRNA-R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。采用25 μL反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板0.5 μL，補ddH2O至25 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，送至寶生物（大連）工程有限公司進行序列測定。

1.2.4 患病大鯢虹彩病毒的PCR檢測 參照文獻[1]設計合成1對特異性擴增虹彩病毒主要核衣殼蛋白（MCP）基因的引物，PCR擴增檢測虹彩病毒MCP基因，預期擴增片段大小為510 bp。MCP-F：5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′，MCP-R：5′-GTCTC

TGGAGAAGAAGAA-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀及病理剖檢結(jié)果

大鯢因更換餌料而突然發(fā)病。發(fā)病初期大鯢行動緩慢，攝食量減少，5～7 d后出現(xiàn)腹部腫脹，前、后肢嚴重腫脹、潰爛，口腔黏膜彌漫性出血。用青霉素和慶大霉素浸泡，部分進行肌肉注射治療無效，并在治療過程中陸續(xù)死亡，發(fā)病大鯢死亡率高達90%。對病死大鯢進行病理剖檢，下頜與腹部肌肉組織出現(xiàn)充血，腹腔內(nèi)有大量淡黃色的積水，肝臟腫大，有淤血呈花斑狀，膽囊充盈，脾臟、腎臟腫大，腸道充血出血，腸壁內(nèi)充滿了淡黃色的漿液（圖1）。

2.2 細菌的分離培養(yǎng)

采用無菌操作取患病大鯢的肝臟組織，用接種環(huán)接種在普通瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后長出1.0～2.5 mm大小的菌落，其表面光滑、濕潤、有光澤、邊緣整齊、呈黃色。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陰性，其兩端鈍圓、散在或個別成雙排列、無芽孢。

2.3 生化鑒定及藥敏試驗結(jié)果

將分離得到的菌株進行生化鑒定，該菌能分解七葉苷，氧化酶陽性，不能分解甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、葡萄糖、肌醇、乳糖，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素，硝酸鹽還原陰性，鳥氨酸脫羧酶、精氨酸水解酶、水楊素、賴氨酸脫羧酶陰性，MR試驗和VP試驗均為陰性。

藥敏試驗結(jié)果表明，該菌株對頭孢噻吩、頭孢拉定高度敏感，對慶大霉素、氟哌酸、頭孢三嗪、強力霉素、頭孢唑啉、卡那霉素、四環(huán)素、青霉素、氨芐青霉素、紅霉素、潔霉素、多粘菌素B、痢特靈、復方新諾明、利福平、鏈霉素不敏感。

2.4 16S rRNA基因序列分析

將分離菌株的16S rRNA序列與GenBank中柱狀黃桿菌的16S rRNA基因進行比對，核苷酸同源性為99%以上，結(jié)合細菌生化鑒定及藥敏試驗結(jié)果，表明分離到的病原菌為柱狀黃桿菌。

2.5 虹彩病毒的PCR檢測

從3只患病大鯢肝組織中均擴增到預期大小約510 bp的DNA片段（圖2）。測序后使用DNAStar軟件進行多序列比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列和虹彩病毒MCP基因有96%～99%的同源性，結(jié)果表明大鯢感染了虹彩病毒。

3 防治措施

綜合流行病學調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室診斷結(jié)果，該養(yǎng)殖場發(fā)生的以體表和四肢多處潰爛、內(nèi)臟器官出現(xiàn)充血、出血為特征的大鯢疾病，診斷為虹彩病毒和柱狀黃桿菌混合感染。確診后，將患病大鯢與健康大鯢進行隔離，對未患病大鯢應用黃芪多糖、電解多維、葡萄糖進行浸泡，連用7 d。對養(yǎng)殖場、養(yǎng)殖水體及養(yǎng)殖用具等用聚維酮碘和高錳酸鉀徹底消毒。同時進行虹彩病毒抽樣PCR檢測，嚴格控制進出人員數(shù)量，工作人員在進入養(yǎng)殖場之前必須通過消毒池和紫外燈通道進行消毒。對患病大鯢采用水產(chǎn)用20 mg/kg頭孢拉定進行腹腔注射，同時應用水產(chǎn)用高效維生素C和維生素E進行浸泡，每天1次，連用7 d。20 d后發(fā)病的大鯢部分開始攝食，死亡數(shù)量明顯減少，疫情得到了遏制。

4 小結(jié)與討論

隨著大鯢養(yǎng)殖規(guī)模化和集約化發(fā)展，由于缺乏對引種和餌料消毒的重視。近些年發(fā)生的大鯢疾病，大多為多種病菌并發(fā)、繼發(fā)或混合感染，使大鯢疾病的診斷和防治的難度增加。研究者相繼報道了熒光假單胞菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、弗式檸檬酸桿菌、黃桿菌引起大鯢死亡的病例，且存在幾種菌混合感染[1-4]。本研究中分離的菌株在生化鑒定和藥敏試驗上與黃錦爐等[5]、劉禮輝等[6]等分離的柱狀黃桿菌有所差異，出現(xiàn)這些差異可能是由于地區(qū)、氣候、水質(zhì)條件及實驗室培養(yǎng)條件等方面的不同而產(chǎn)生的，加之細菌對抗生素類藥物的耐藥性具有變異性。因此，本研究將生理生化特性測定與16S rRNA序列分析鑒定相結(jié)合，使鑒定方法更科學，鑒定結(jié)果更可靠、更準確。同時，本研究表明臨床用藥應根據(jù)藥敏試驗結(jié)果合理選擇抗菌藥物進行治療，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

本研究中檢測到的虹彩病毒是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物重要的病毒性病原[7]。耿毅等[8]報道了蛙病毒感染可導致養(yǎng)殖大鯢大規(guī)模死亡。江育林等[9]、高正勇等[10]從患病大鯢體內(nèi)分離到虹彩病毒，并對該病毒的理化及生物學特性進行了研究。針對目前規(guī)模化大鯢養(yǎng)殖場疫病的復雜局面，應樹立保健和預防觀念，采取合理的消毒程序，建立完善的預防方案，加強對餌料魚的檢測與消毒。同時對患病大鯢制定科學的用藥方案，正確配伍，協(xié)同用藥，辨證施治，綜合治療。

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