非典型分支桿菌的分類鑒定方法研究進(jìn)展

摘要：非典型分支桿菌與結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）復(fù)合群、麻風(fēng)分支桿菌（M. leprae）同屬于分支桿菌屬（Mycobacterium）。隨著對(duì)結(jié)核桿菌的深入研究，非典型分支桿菌也逐漸引起了人們的關(guān)注。為了對(duì)非典型分支桿菌進(jìn)行系統(tǒng)的了解和分類鑒定，就國內(nèi)外常用的分類鑒定方法進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：非典型分支桿菌；結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）；分類；鑒定

中圖分類號(hào)：R378.91；C34 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）13-2977-03

非典型分支桿菌是指除了結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）復(fù)合群和麻風(fēng)分支桿菌（M. leprae）之外的其他分支桿菌，包括偶發(fā)分支桿菌（M. fortuitum）、鳥分支桿菌（M. avium）、堪薩斯分支桿菌（M. kanasii）等30多種分支桿菌。非典型分支桿菌生長緩慢，具有一定的致病性，臨床表征與結(jié)核分支桿菌相似，容易造成誤診。因此，對(duì)非典型分支桿菌的分類鑒定就顯得尤為重要。本研究擬對(duì)臨床中常用的分類鑒定方法進(jìn)行綜述，旨在為更深入的研究提供參考。

1 傳統(tǒng)分類方法

培養(yǎng)分支桿菌常用的培養(yǎng)基有固體培養(yǎng)基，如改良羅氏培養(yǎng)基、匡氏瓊脂PNB培養(yǎng)基和Middle brook 7H10、7H11瓊脂培養(yǎng)基，在固體培養(yǎng)基中通過觀察菌落形態(tài)和生長情況鑒定分支桿菌；液體培養(yǎng)基包括Sauton培養(yǎng)基和Middle brook 7H9等，細(xì)菌充分接觸營養(yǎng)物質(zhì)時(shí)易大量獲得細(xì)菌，但缺點(diǎn)是易污染，需先進(jìn)行涂片處理才能觀察菌落形態(tài)。2008年Wang等[1]檢查一位患者咽喉部病變時(shí)，經(jīng)過組織切片和涂片后觀察到侵染細(xì)菌與鳥分支桿菌復(fù)合群相一致。2010年Sajduda等[2]應(yīng)用PRA（PCR restriction analysis）和傳統(tǒng)分離方法鑒定64株分支桿菌，結(jié)果表明PRA優(yōu)于傳統(tǒng)方法和特殊DNA測(cè)序方法。Guarin等[3]在研究區(qū)分龜亞科分支桿菌-膿腫分支桿菌復(fù)合群時(shí)，對(duì)傳統(tǒng)分類方法、高效液相色譜分析方法和實(shí)時(shí)PCR方法進(jìn)行了比較試驗(yàn)。由于傳統(tǒng)鑒定方法耗時(shí)長、對(duì)操作要求十分嚴(yán)格、培養(yǎng)物易受外界環(huán)境污染，所以在實(shí)際工作中不易被采用。高效液相色譜法雖然可被廣泛應(yīng)用于非結(jié)核性分支桿菌的分類鑒定，但是該方法不能將龜亞科分支桿菌-膿腫分支桿菌復(fù)合群里的成員區(qū)分開。相對(duì)前兩種方法，采用實(shí)時(shí)PCR方法更為快捷省時(shí)、操作簡(jiǎn)單，大大提高了工作效率。

2 全自動(dòng)分支桿菌快速生長培養(yǎng)儀檢測(cè)方法

20世紀(jì)70年代末，BD公司研制的BACTEC 460-TB成為全球第一臺(tái)專業(yè)的全自動(dòng)分支桿菌培養(yǎng)鑒定儀，該系統(tǒng)培養(yǎng)基以Middle brook 7H12為基礎(chǔ)，在培養(yǎng)基中加入標(biāo)記14C的棕櫚酸，因此也稱為放射性同位素液體培養(yǎng)法。張敦熔[4]在Middle brook系列培養(yǎng)基中加入NAP及其他選擇性抑制劑，將培養(yǎng)出來的細(xì)菌經(jīng)過分析儀檢測(cè)能夠快速鑒定出結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌，該技術(shù)解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法耗時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，使細(xì)菌快速培養(yǎng)成為現(xiàn)實(shí)。Kontos等[5]應(yīng)用全自動(dòng)分支桿菌快速生長培養(yǎng)儀BACTEC MGIT960和PCR-RFLP相結(jié)合的方法檢測(cè)從臨床樣本中分離到的分支桿菌，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)生化試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果相一致，但在檢測(cè)的敏感性和時(shí)間上明顯優(yōu)于常規(guī)檢測(cè)方法。

3 噬菌體分析方法

胡忠義等[6]應(yīng)用分支桿菌噬菌體D29采用噬菌體生物擴(kuò)增法鑒定結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌，經(jīng)過37 ℃感染1 h，結(jié)果結(jié)核分支桿菌生物擴(kuò)增檢測(cè)為陽性，非結(jié)核分支桿菌檢測(cè)為陰性。呂斌等[7]應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建可表達(dá)熒光素酶的結(jié)核分支桿菌重組噬菌體。由于噬菌體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，且不同的分支桿菌發(fā)光水平不同，因此重組噬菌體分析方法是一種鑒別結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌的有效方法。

4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域。由于PCR技術(shù)具有快速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在分支桿菌鑒定方面也是一種常用的鑒定方法。李國利等[8]利用雙重PCR技術(shù)尋找結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌之間的特異性條帶，旨在快速鑒定結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌。侯瑞生等[9]利用多重PCR體系將臨床病例標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢測(cè)比較，結(jié)果顯示對(duì)病例標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)菌株的檢測(cè)靈敏度達(dá)到94.6%，特異性達(dá)到100.0%。吳雪瓊等[10]利用不同細(xì)菌的單鏈DNA構(gòu)象不同的特點(diǎn)，建立了PCR-SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，用以區(qū)別結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌。Yamada-Noda等[11]根據(jù)dnaJ基因建立PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明，在54株模式株中，dnaJ的同源性為80.4%，低于16S rRNA的96.6%、rpoB的91.3%和hsp65的91.1%，dnaJ PCR技術(shù)可以作為一種新的方法區(qū)別結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌，利用通用引物建立PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行測(cè)序分析可以準(zhǔn)確地鑒定出多種分支桿菌。Selvaraju等[12]利用hsp65基因限制性分析龜亞科分支桿菌復(fù)合群，該方法根據(jù)hsp65基因的多態(tài)性可以將復(fù)合群里的每種菌株分別鑒定出來。Martin等[13]利用生化方法、hsp65基因PCR-RFLP和PRA技術(shù)鑒定從人類臨床標(biāo)本中分離出分支桿菌，結(jié)果表明，相對(duì)一般生化方法，PRA技術(shù)操作簡(jiǎn)單、方便、快捷，是一種可靠的鑒定方法。Sajduda等[14]應(yīng)用PRA配合毛細(xì)管電泳法，分離鑒定出27株堪薩斯分支桿菌和29株龜分支桿菌-膿腫分支桿菌復(fù)合群。結(jié)果表明，PRA技術(shù)配合毛細(xì)管電泳法能夠快速準(zhǔn)確地鑒定分支桿菌。

5 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是將一段帶有標(biāo)記的核酸片段在一定的溫度、pH等條件下與核酸互補(bǔ)鏈通過氫鍵結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，經(jīng)過顯影技術(shù)顯示結(jié)果。李國利等[15]以16 S-23 S rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列為靶基因設(shè)計(jì)核酸探針，利用PCR-反向雜交技術(shù)可以將分支桿菌鑒定到種的水平。還可以利用生物素標(biāo)記臨床樣本的核酸制成探針，與標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA雜交，以大腸桿菌作為陰性對(duì)照，可以快速將細(xì)菌鑒定到種。梁建琴等[16]運(yùn)用16 S rRNA-寡核苷酸探針反向雜交陣列法檢測(cè)臨床樣本中的分支桿菌，結(jié)果顯示寡核苷酸探針特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高，可作為鑒定臨床分支桿菌菌種的方法。Tobler等[17]采用hsp65實(shí)時(shí)PCR和DNA微陣列法快速檢測(cè)37株分支桿菌，結(jié)果鑒定出34株分支桿菌，與16 S rRNA的測(cè)序結(jié)果一致。Sun-Joon等[18]采用rpoB PCR-反向DNA寡核苷酸特異性探針鑒定分支桿菌，從504株臨床樣本中分離出48株鳥分支桿菌和60株胞內(nèi)分支桿菌，其他菌株經(jīng)鑒定分別為366株結(jié)核分支桿菌、9株膿腫分支桿菌、8株偶發(fā)分支桿菌、2株淺黃分支桿菌和11株外來分支桿菌。該方法快速、準(zhǔn)確、敏感度高、特異性強(qiáng)。

6 細(xì)胞脂肪酸成分分析方法

將細(xì)菌制成凍干粉后，將粉末經(jīng)過甲酯化，供氣相色譜儀或色譜/質(zhì)譜儀（GC/MS）分析，由于非結(jié)核分支桿菌含有結(jié)核分支桿菌所沒有的特征脂肪酸，經(jīng)過儀器分析鑒定出異十六烷酸、異十七烷酸、十六烯酸、十八烯酸、十八二烯酸等成分，進(jìn)一步探明了其組分的化學(xué)本質(zhì)，鑒定出戈登分支桿菌（M. gordonae）無結(jié)核分支桿菌硬脂酸，牛型結(jié)核分支桿菌（M. bovis）沒有α-甲基十八烯酸，為分支桿菌脂肪酸分析提供了科學(xué)依據(jù)。美國MIDI公司生產(chǎn)的全細(xì)胞脂肪酸分析系統(tǒng)，通過使用安捷倫的氣相色譜、MIDI微生物數(shù)據(jù)庫和MIDI圖譜識(shí)別軟件來鑒定每個(gè)菌株，對(duì)菌株的鑒定表現(xiàn)得更為客觀，減少了人為因素造成的錯(cuò)誤，并能鑒定到種的水平。

7 氣相色譜法和薄層層析法

將氣相色譜法與傳統(tǒng)生物學(xué)鑒定方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果兩種方法鑒定出的分支桿菌94.0%相符合。用氣相色譜法和薄層層析法相結(jié)合將28種標(biāo)準(zhǔn)菌株中85.0%的菌株區(qū)分開來。另外，Rebuffo-Scheer等[19]利用傅里葉變換紅外顯微分光鏡檢查法鑒別分支桿菌。利用紅外線光譜得到的線性反應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)化模式，可以根據(jù)光譜分析快速檢測(cè)臨床標(biāo)本的未知分支桿菌。

8 結(jié)語

臨床中用于鑒定非典型分支桿菌的方法很多，以上介紹的是國內(nèi)外較為常用的幾種分類鑒定方法。每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，因此，往往根據(jù)實(shí)際需要采用幾種方法聯(lián)合應(yīng)用，如利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，再配合PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)進(jìn)行鑒定，或者利用PCR技術(shù)與反向核酸探針技術(shù)相結(jié)合的方法，能夠更加系統(tǒng)、全面地對(duì)非典型分支桿菌進(jìn)行分類鑒定，對(duì)臨床研究非典型分支桿菌有很大的幫助。

參考文獻(xiàn)：

[1] WANG B Y， AMOLAT M J， WOO P， et al. Atypical mycobacteriosis of the larynx： An unusual clinical presentation secondary to steroids inhalation[J]. Annals of Diagnostic Pathology，2008，12（6）：426-429.

[2] SAJDUDA A， MARTIN A， PORTAELS F， et al. hsp65 PCR-restriction analysis（PRA） with capillary electrophoresis in comparison to three other methods for identification of Mycobacterium species[J]. Journal of Microbiological Methods， 2010， 80（2）：190-197.

[3] GUARIN N， BUDVYTIENE I， GHAFGHAICHI L， et al. Comparison of real-time polymerase chain reaction and conventional biochemical methods for identification of Mycobacterium chelonae-Mycobacterium abscessus group to the species level[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2010， 67（4）：333-336.

[4] 張敦熔.現(xiàn)代結(jié)核病學(xué)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2000.17-19.

[5] KONTOS F， PETINAKI E， GITTI Z， et al. Combined use of the fully automated Bactec MGIT 960 System and a PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for routine detection and identification of mycobacteria from clinical samples[J]. Journal of Microbiological Methods，2003，52（1）：137-140.

[6] 胡忠義，倪蓮娣，張瑩蓉，等.噬菌體生物擴(kuò)增法在分支桿菌鑒定和藥敏試驗(yàn)中的應(yīng)用[J].中國防癆雜志，2003，25（Z1）：63-64.

[7] 呂 斌，符志軍，徐順清，等.利用重組分支桿菌噬菌體快速篩選耐利福平結(jié)核分支桿菌[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2000，23（8）：480-484.

[8] 李國利，莊玉輝，趙 銘，等.應(yīng)用雙重PCR技術(shù)快速鑒定結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2000，10（1）：14-15，18.

[9] 侯瑞生，王 麗，陳文玲，等.多重聚合酶鏈反應(yīng)方法在結(jié)核桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2007，30（6）：387-388.

[10] 吳雪瓊，張俊仙，劉佳文，等.PCR-SSCP分支桿菌菌種初步鑒定方法的建立及其應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2000，10（7）：25-26.

[11] YAMADA-NODA M，OHKUSU K， HATA H， et al. Mycobacterium species identification ——A new approach via dnaJ gene sequencing[J]. Systematic and Applied Microbiology，2007，30（6）：453-462.

[12] SELVARAJU S B，KHAN I U H， ADAV J S. A new method for species identification and differentiation of Mycobacterium chelonae complex based on amplified hsp65 restriction analysis（AHSPRA）[J]. Molecular and Cellular Probes，2005，19（2）：93-99.

[13] MARTIN A， UWIZEYE C， FISSETTE K， et al. Application of the hsp65 PRA method for the rapid identification of mycobacteria isolated from clinical samples in Belgium[J]. Journal of Microbiological Methods，2007，71（1）：39-43.

[14] SAJDUDA A， MARTIN A， PORTAELS F， et al. hsp65 PCR-restriction analysis （PRA） with capillary electrophoresis for species identification and differentiation of Mycobacterium kansasii and Mycobacterium chelonae-Mycobacterium abscessus group[J]. International Journal of Infectious Diseases， 2012，16（3）：193-197.

[15] 李國利，莊玉輝，趙 銘，等.16S-23S rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列寡核苷酸探針鑒定分支桿菌菌種的研究[J].中國防癆雜志，2002，24（Z1）：12-16.

[16] 梁建琴，吳雪瓊，張俊仙，等.應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-膜芯片技術(shù)快速鑒定分支桿菌菌種[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（5）：289-292.

[17] TOBLER N E，PFUNDER M，HERZOG K，et al. Rapid detection and species identification of Mycobacterium spp. using real-time PCR and DNA-Microarray[J]. Journal of Microbiological Methods，2006，66（1）：116-124.

[18] SUN-JOON B， JIN-SEONG E， YOUNG-DOO P， et al. PCR-linked reverse DNA hybridization using oligonucleotide-specific probes of rpoB for identification of Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare[J]. Journal of Microbiological Methods，2010，83（3）：291-295.

[19] REBUFFO-SCHEER C A，KIRSCHNER C， STAEMMLER M， et al. Rapid species and strain differentiation of non-tubercoulous mycobacteria by fourier transform infrared microspectroscopy[J]. Journal of Microbiological Methods，2007，68（2）：282-290.