基于DNA水平的食品致病菌檢測方法應(yīng)用研究

【摘 要】研究表明，越來越多的食物中毒是由食源性微生物導(dǎo)致的。為此，如何快速地檢測出食源性致病菌是保障食品衛(wèi)生與安全重要內(nèi)容。在食品快速檢測方法中，DNA分子水平的檢測具有特異性強和靈敏性高的特征。本文就目前具有代表性的基因探針技術(shù)、PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)等DNA分子生物學(xué)技術(shù)在食源性致病菌快速檢測中的應(yīng)用研究進行綜述。

【關(guān)鍵詞】食源性致病菌 基因探針 基因芯片技術(shù)

食源性致病菌是影響食品質(zhì)量與安全的重要因素，引發(fā)的食品安全問題也逐漸增多。目前，沙門氏菌、大腸埃希氏菌等病菌主要存在于乳制品、肉制品等加工食品中，致病性較強。常規(guī)的微生物檢驗方法遵循“先分離培養(yǎng)、后生化鑒定”原則，需要消耗3～5天的時間。這種方法繁瑣、時間成本高，與當(dāng)前嚴格的食品質(zhì)量控制與貿(mào)易需求是相矛盾的。因此，迫切需要建立食源性致病菌的快速檢測方法和體系。

伴隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，食源性致病菌的檢測已經(jīng)從簡單的形態(tài)、生理特征檢測上升到DNA水平的檢測和應(yīng)用。本文將闡明主要的分子生物學(xué)技術(shù)檢測食品致病菌的機理，并舉例說明其在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用。

1 基因探針技術(shù)

基因探針技術(shù)，即DNA探針技術(shù)。DNA探針是最常用、長度為幾百bp以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。其中，人工合成的帶有放射性或生物素標(biāo)記的單鏈DNA片段作為探針，通過與固定在硝酸纖維素膜的DNA或RNA進行互補結(jié)合，經(jīng)放射自顯影等技術(shù)即可判斷膜上是否有同源的核酸分子存在，從而檢測快速檢測病原體。近年來，DNA探針技術(shù)廣泛應(yīng)用于沙門氏菌等食品致病菌的檢驗，如以生物素標(biāo)記的基因片段作為探針檢測沙門氏菌的敏感度為80個細菌/g。無需分離培養(yǎng)的大腸桿菌商品化DNA探針系統(tǒng)，可在1h內(nèi)完成檢測食品病原微生物的操作，靈敏度為103個細菌/ml。

目前，DNA探針技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、省時等特征，是定量檢測特異RNA或基因序列的有力工具，可用于檢測任何特定病原微生物。

2 PCR技術(shù)及其衍生技術(shù)

PCR技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的縮寫，是一種在體外快速擴增特定DNA序列的方法。該技術(shù)需要人工合成的兩個寡核苷酸作為引物，經(jīng)過DNA變性、模板-引物復(fù)性、TaqDNA聚合酶催化下的引物鏈延伸反應(yīng)等循環(huán)過程，即可快速地使靶DNA擴增數(shù)百萬倍。1993年，Song等采用PCR技術(shù)檢測到血液中的傷寒沙門氏菌的DNA。此后，科學(xué)家們對比不同血清型的沙門氏菌和已知的被該菌污染的動物產(chǎn)品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR技術(shù)只需1d即可檢測出產(chǎn)品的差異，且最低檢出量達到0.05pgDNA。Johenson等研究建立一套通過檢測葡萄球菌腸毒素基因，從而快速、靈敏地檢出金黃色葡萄球菌的存在的PCR技術(shù)。

2.1RT-PCR技術(shù)

RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)。逆轉(zhuǎn)錄PCR可以有效地檢測細胞/組織中基因的表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列，因此，可以有效地檢測有活性的菌株，防止假陽性的出現(xiàn)。該技術(shù)的關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。

目前，反轉(zhuǎn)錄PCR方法不僅被應(yīng)用于食源性致病菌的檢測，而且也被用于分析食源性致病菌生長或侵染過程中特定基因表達量的變化，具有較強的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.2實時定量PCR

實時定量PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的累積實時監(jiān)測整個PCR過程。最后，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。該方法與反轉(zhuǎn)錄結(jié)合，可以定量分析某種基因是否表達及其mRNA的含量。今年，通過設(shè)計hlyA基因引物和TaqMan探針，建立了實時定量PCR檢測單增李斯特菌的方法，其檢測底線為1cfuPg，整個流程只需27h。

目前，與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，實時定量PCR技術(shù)所需的食品基質(zhì)和培養(yǎng)基成分也會影響反應(yīng)體系中酶的活性，引起結(jié)果偏差或假陽性結(jié)果。

2.3免疫PCR技術(shù)

免疫PCR技術(shù)是綜合了免疫學(xué)和PCR技術(shù)的新型檢測技術(shù)。該技術(shù)的關(guān)鍵措施是要將抗體置于微板中以捕捉經(jīng)異源DNA連接的抗原，并通過DNA的PCR擴增進行定量分析。利用改良的免疫PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B，包被載體用戊二醛處理的普通PCR管，可以將檢測靈敏度提高到夾心ELISA的1000倍。西瓜細菌性果斑病菌是通過種子傳播，而種子的帶菌率一般只有1%～5%，利用免疫PCR 技術(shù)不需要大規(guī)模的分離培養(yǎng)，便可以快速有效地檢測病原菌。用該方法檢測食品中的沙門氏菌沒有假陽性和假陰性的出現(xiàn)，符合食品中病原微生物的快速檢測要求[5]。

因此，免疫PCR技術(shù)具有極強的特異性，防止假陽性和假陰性的出現(xiàn)，確保食品質(zhì)量的安全。

3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是基于芯片上的探針與樣品中的靶基因片段之間發(fā)生的特異性的一種核酸雜交技術(shù)。通過微生物樣品處理、核酸提取與擴增、熒光素標(biāo)記、與芯片上的寡核苷酸點雜交、掃描儀定量熒光分布分析等環(huán)節(jié)，該技術(shù)可以確定樣品中是否存在特定的微生物。近年，運用基因芯片技術(shù)成功檢測出食品中的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單核細胞增生李斯特菌等致病菌。Keramas等用基因芯片技術(shù)檢測發(fā)熱雞糞便中的空腸彎曲菌和大腸彎曲菌時，陽性檢出率明顯高于傳統(tǒng)微生物檢驗方法。此外，Call等建立了將免疫誘捕技術(shù)、PCR與基因芯片技術(shù)相結(jié)合，對雞肉中致病菌進行檢測，其靈敏度可達到低于102CFU/mL。

目前，基因芯片技術(shù)已經(jīng)廣泛運用于食品安全、病理和轉(zhuǎn)基因食品的檢測領(lǐng)域。

4結(jié)語

傳統(tǒng)的食源性致病菌鑒定技術(shù)需要1周左右的時間，而且檢測的結(jié)果不夠準(zhǔn)確和具有嚴謹?shù)恼f服力。DNA水平的快速檢測技術(shù)將在食品原料、工藝流程、產(chǎn)品質(zhì)量等方面得到廣泛實踐，并為食品安全管理體系的建立奠定良好的基礎(chǔ)。但是，DNA水平的快速檢測技術(shù)存在檢測成本高、缺乏相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)等不足。因此，積極組織研究所、大專院校和企業(yè)的專家建立國家標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，加快DNA分子檢測技術(shù)的研究是今后發(fā)展方向。

【參考文獻】

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