牛布魯氏菌病間接ELISA 檢測方法的建立及應(yīng)用

吳同壘，冀夢瑤，于秀劍，杜萬年，張志強(qiáng)，吳清民，史秋梅*

（1. 河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066004；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的包括人在內(nèi)的多種動物共患的細(xì)菌病，可造成患病動物流產(chǎn)或不育，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展，對人類健康造成極大威脅[1]。結(jié)合現(xiàn)階段國情，我國執(zhí)行疫苗免疫接種和檢疫-撲殺相結(jié)合的防控方式。目前動物布病檢疫依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷，主要方法有：布魯氏菌的分離鑒定、虎紅凝集實(shí)驗(yàn)、試管凝集實(shí)驗(yàn)、PCR 技術(shù)、間接ELISA（iELISA）和補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)等[2-3]。細(xì)菌分離實(shí)驗(yàn)要求高，且分離率非常低。PCR 檢測方法敏感性高，但特異性差。補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)具有良好的特異性和敏感性，但是同樣存在實(shí)驗(yàn)要求較高的缺點(diǎn)。虎紅凝集實(shí)驗(yàn)和試管凝集實(shí)驗(yàn)敏感性較高，但易與耶爾森菌O∶9 和大腸桿菌O∶157 發(fā)生交叉反應(yīng)[4]。與凝集實(shí)驗(yàn)相比，iELISA 敏感性要高出10～100 倍，特異性也高于凝集和補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，且穩(wěn)定性好，易于操作和標(biāo)準(zhǔn)化[5-6]。尋找布魯氏菌的優(yōu)勢抗原、建立抗體檢測iELISA 診斷方法是布魯氏菌診斷研究的重要方向。

HSP70，又稱為DnaK，其主要功能是幫助蛋白質(zhì)的折疊與成熟[7]。相關(guān)研究顯示，HSP70 能夠引起宿主特異性免疫應(yīng)答，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，介導(dǎo)宿主對相應(yīng)病原的免疫保護(hù)[8]；同時該基因的缺失可造成細(xì)菌的毒力降低[9]。因此，本研究選擇牛種布魯氏菌HSP70 基因，對其進(jìn)行原核表達(dá)、蛋白純化，并建立布魯氏菌抗體檢測的iELISA 方法，為建立有效鑒定牛布魯氏菌感染的方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 布魯氏菌（B.abortus2308）滅活菌株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所布病參考實(shí)驗(yàn)室惠贈；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

SDS-PAGE 凝膠電泳試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、明膠購自北京盈信陽光生物技術(shù)有限公司；Ni-瓊脂糖凝膠購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；特級馬血清，購自北京索萊寶生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶購自Thermo Fisher Scientific。牛布魯氏菌陽性和陰性臨床血清由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳清民教授惠贈。120 份臨床血清樣本采集自秦皇島地區(qū)未進(jìn)行布魯氏菌病免疫的規(guī)?；馀ｐB(yǎng)殖場。鼠源His 單抗隆抗體和HRP-兔抗牛IgG 購自北京索萊寶科技有限公司。牛布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性血清，和傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）陽性血清均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛粘膜病病毒（BVDV）和口蹄疫病毒（FMDV）陽性血清為本實(shí)驗(yàn)室保存。

提取B.abortus2308 基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增HSP70 基因。將擴(kuò)增的基因片段純化后克隆至pET32a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-HSP70，經(jīng)BamHI/Xho I 酶切鑒定陽性質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測 按照常規(guī)方法將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，誘導(dǎo)表達(dá)后超聲裂解，分離上清和沉淀，SDS-PAGE 分析蛋白表達(dá)形式，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni 柱純化后利用Nanodrop2000 定量。同時以牛布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為一抗（1∶6 000 稀釋），HRP-羊抗牛IgG 為二抗（1∶8 000），對表達(dá)蛋白進(jìn)行western blot 分析。

1.4 檢測牛布魯氏菌抗體的iELISA 方法的優(yōu)化取標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清，以純化的蛋白作為抗原進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化iELISA 的反應(yīng)條件：分別設(shè)置抗原包被濃度梯度為4 ng/μL、2 ng/μL、1 ng/μL和0.5 ng/μL，4 ℃包被過夜；血清稀釋度為1/50、1/100、1/200 和1/400，37 ℃孵育1 h；封閉液類型包括5%脫脂奶、10%脫脂奶、1%BSA、1%明膠和10%馬血清；二抗稀釋度選擇1/1 000、1/2 000、1/4 000和1/6 000，37 ℃孵育1h；顯色時間分別是5 min、10 min、15 min 和20 min。使用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)后，檢測OD450nm。在確定最佳反應(yīng)條件時，通常選擇陽性O(shè)D值為1，且P/N值最大時為最佳反應(yīng)條件。

1.5 iELISA 方法臨界值（CUT OFF）的確定 取64份陰性臨床血清分析本研究建立的iELISA 方法的臨界值。臨界值=平均值+2.58×標(biāo)準(zhǔn)差，即臨床樣品的OD450nm值大于或等于臨界值為陽性，OD450nm值小于臨界值為陰性。

1.6 iELISA 方法的特異性試驗(yàn) 利用本實(shí)驗(yàn)建立的iELISA 方法分別檢測IBR、BVD 和FMD 陽性血清，同時設(shè)布魯氏菌病陰陽性血清作為陰陽對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判定是否有交叉反應(yīng)。

1.7 iELISA 方法的敏感性試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行倍比稀釋（1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800 和1∶1 600），利用本實(shí)驗(yàn)建立的iELISA 方法進(jìn)行檢測，計(jì)算能夠有效檢出的最高稀釋度，分析該方法的敏感性。

1.8 iELISA 方法的重復(fù)性試驗(yàn) 利用同一批抗原包被的ELISA 板，隨機(jī)取6 份陽性血清進(jìn)行iELISA檢測，每個樣品做5 個平行孔，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)；選擇3 個不同批次抗原包被的ELISA 板，對上述6 份陽性血清樣本進(jìn)行iELISA 檢測，每個樣品5個平行孔，進(jìn)行批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。分析檢測結(jié)果，評估本研究建立的iELISA 的重復(fù)性。

1.9 與經(jīng)典方法的比較及初步應(yīng)用試驗(yàn) 利用本實(shí)驗(yàn)建立的iELISA 方法與經(jīng)典的虎紅凝集和試管凝集實(shí)驗(yàn)方法對實(shí)驗(yàn)室保存的96 份血清進(jìn)行檢測，比較兩種方法的符合率。同時，利用該方法對120 份臨床血清樣本進(jìn)行檢測，計(jì)算抗體陽性率。對陽性血清樣本利用虎紅凝集和試管凝集實(shí)驗(yàn)復(fù)檢。

2 結(jié) 果

2.1 HSP70 基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET32a-HSP70鑒定 以B.abortus2308基因組為模板進(jìn)行PCR，結(jié)果顯示，擴(kuò)增目的片段預(yù)期HSP70 基因編碼區(qū)長度一致，約為1 300 bp（圖1）。重組質(zhì)粒pET32a-HSP70 經(jīng)酶切鑒定及測序均顯示構(gòu)建正確，基因序列無突變?nèi)笔В▓D略）。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)獲得了正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-HSP70。

2.2 重組蛋白的表達(dá)、鑒定及純化 將重組質(zhì)粒pET32a-HSP70 轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示，表達(dá)的目的蛋白條帶大小約70 ku，符合預(yù)期（圖2A），其主要以包涵體形式表達(dá)。western blot 結(jié)果顯示，所表達(dá)的目的蛋白具有抗原性（圖2B）。蛋白經(jīng)過Ni 柱純化后獲得純化的目的蛋白純度較高，濃度為0.418 mg/mL（圖2C）。

圖1 hsp70 的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR for hsp70

圖2 HSP70 基因的表達(dá)、驗(yàn)證及純化Fig.2 Prokaryotic expression,western blot and purification of HSP70 gene

2.3 iELISA 方法的優(yōu)化結(jié)果 采用正交實(shí)驗(yàn)對iELISA 方法進(jìn)行條件優(yōu)化，最佳反應(yīng)條件如表1所示。

表1 間接ELISA 檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the indirect ELISA

2.4 臨界值的確定 選擇64 份陰性血清用于確定iELISA 方法的臨界值，結(jié)果顯示，檢測數(shù)據(jù)經(jīng)SPASS K-S 方法檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布（圖3）。計(jì)算得到樣本平均值為0.098，標(biāo)準(zhǔn)差為0.034，根據(jù)公式臨界值=平均值+2.58×標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算臨界值=0.186，即本研究建立的iELISA 方法，OD450nm值≥0.186 為陽性，OD450nm值＜0.186 則為陰性。

圖3 陰性樣品結(jié)果正態(tài)分布圖Fig.3 Negative samples normal distribution diagram

2.5 iELISA 方法的特異性分析 利用以HSP70 為包被抗原建立的iELISA 方法對牛常見病毒陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示均為陰性（表2），與這幾種病原的標(biāo)準(zhǔn)血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，表明本研究建立的iELISA方法具有較好的特異性。

表2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of specificity test

2.6 iELISA 的敏感性分析 利用本試驗(yàn)建立的iELISA 方法對不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示血清稀釋度為1∶400 時OD450nm仍大于0.186，判定為陽性。表明該方法的敏感性良好。

2.7 iELISA 方法的重復(fù)性試驗(yàn) 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為3.39%～6.44%，批間變異系數(shù)為2.32%～9.42%（表3），均未超過10%。表明本實(shí)驗(yàn)建立的iELISA 方法具有良好的重復(fù)性。

2.8 與經(jīng)典方法的比較及初步應(yīng)用 分別選取經(jīng)虎紅凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)確定的48 份陽性血清和48 份陰性血清進(jìn)行iELISA 檢測。計(jì)算得出陽性樣品符合率：（48-6）/48=87.5%，陰性樣品符合率：（48-8）/48=83.3%。

表3 間接ELISA 重復(fù)性試驗(yàn)（n=6）Table 3 Repeatability detection for indirect ELISA(n=6）

利用本實(shí)驗(yàn)建立的iELISA 方法對采集的120 份臨床血清檢測，結(jié)果顯示，其中3 份樣品抗體陽性，陽性率為2.5%。對3 份陽性血清進(jìn)行虎紅凝集試驗(yàn)分析，結(jié)果顯示強(qiáng)陽性；試管凝集試驗(yàn)分析，結(jié)果顯示其效價均為1∶100 以上。以上結(jié)果表明本方法的可靠性高，可用于布魯氏菌病的臨床檢測。

3 討 論

布魯氏菌病是人畜共患傳染病，對養(yǎng)殖業(yè)和人類公共衛(wèi)生健康造成巨大威脅[1]。本研究建立了牛布魯氏菌血清抗體檢測iELISA 方法，具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，能夠有效檢測牛布魯氏菌病，且與傳統(tǒng)布病檢測方法符合率較高，有望作為牛布魯氏菌病的血清學(xué)檢測方法。

研究顯示，基于光滑性布魯氏菌LPS 的診斷試劑常常與耶爾森菌、大腸桿菌、沙門菌的某些血清型、土拉桿菌和霍亂弧菌等發(fā)生交叉反應(yīng)[10]。2018版動物布病診斷技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T18146-2018）規(guī)定了幾種動物布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)，針對血清的檢測方法主要有虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)、試管凝集和微量凝集實(shí)驗(yàn)，以及iELISA 實(shí)驗(yàn)，這幾種方法均為檢測牛血清中針對布魯氏菌LPS 的抗體。由于LPS 的特異性不足，為進(jìn)一步減少誤檢率，人們開始篩選能夠刺激牛產(chǎn)生血清抗體的布魯氏菌蛋白抗原。Sascha 等利用免疫二維電泳技術(shù)鑒定出包括DnaK（HSP70）在內(nèi)的6 種布魯氏菌免疫原性蛋白，提示其作為iELISA檢測方法靶標(biāo)抗原的可能[11-12]。因此本研究對HSP70進(jìn)行原核表達(dá)，并初步建立了iELISA 診斷方法，為牛布魯氏菌病的血清學(xué)檢測提供了重要方法。

與傳統(tǒng)的虎紅凝集和試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，本研究建立的iELISA 方法陽性符合率87.5%，陰性符合率為83.3%，存在一定差異。原因可能有以下幾個方面：一是傳統(tǒng)方法本身存在一定假陽性和假陰性，二是虎紅凝集和試管凝集實(shí)驗(yàn)是基于布魯氏菌LPS 抗原的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，而布魯氏菌抗原DnaK 和LPS 引起的抗體水平在時間上并不完全一致[13-14]。為解決這個問題，應(yīng)進(jìn)一步分析iELISA的檢測時間，合理增加檢疫的時間密度，同時為增加陽性檢出率，可通過進(jìn)一步改善反應(yīng)條件，提高DnaK 的純化效果等方法優(yōu)化iLIESA 方法。

本課題組后續(xù)研究擬采取截短表達(dá)或者篩選單克隆抗體的方式進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，改進(jìn)該檢測方法。本研究利用牛種布魯氏菌HSP70 重組蛋白初步建立了iELISA 診斷方法，為布魯氏菌的血清學(xué)診斷方法的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。