高效液相色譜儀自動進(jìn)樣器校準(zhǔn)方法及不確定度評定*

王冠杰，季士委，田利，曹守春，鄒健

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

楊洋

（北京市計(jì)量檢測科學(xué)研究院，北京 100029）

高效液相色譜儀是復(fù)雜樣品定性和定量分析的常用設(shè)備，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品科學(xué)、環(huán)境科學(xué)和航天科學(xué)等多個領(lǐng)域［1］。在藥品檢測領(lǐng)域，使用高效液相色譜法的標(biāo)準(zhǔn)品種從1985 年版藥典的7 種，增加至2005 年版藥典的1 327 種［2］，2010年版《中國藥典》［3］更是增加至約2 000 種，其在藥品檢驗(yàn)領(lǐng)域中的作用日益顯著。隨著液相色譜技術(shù)的發(fā)展，高端液相色譜儀多數(shù)配備了自動進(jìn)樣器，而目前我國液相色譜儀檢定規(guī)程沒有提供自動進(jìn)樣器校準(zhǔn)方法［4］。在檢測樣品尤其是微量樣品的過程中，自動進(jìn)樣器是否準(zhǔn)確直接影響檢測結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性［5-6］。

中國食品藥品檢定研究院作為國家級藥品檢測機(jī)構(gòu)，在申請WHO 預(yù)認(rèn)證中，按照歐洲醫(yī)藥管理局（OMCL）《質(zhì)量控制文件》［7］提供的計(jì)量方法為基礎(chǔ)，對液相色譜自動進(jìn)樣器進(jìn)行校準(zhǔn)。

現(xiàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和OMCL 提供的方法，歸納自動進(jìn)樣器檢測方法并對進(jìn)樣體積誤差不確定度進(jìn)行評定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Waters e2695 型，新加坡Waters Pacific Pte Ltd 公司；

電子天平：ME414S 型，量程為0～410 g，分度值為0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；

甲醇：色譜純；

萘-甲醇溶液：100 μg／mL，國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［GBW(E) 130167］，中國計(jì)量科學(xué)研究院；

實(shí)驗(yàn)用水：一級水（電阻率≥18 MΩ·cm）。

1.2 色譜條件

1.2.1 進(jìn)樣體積誤差實(shí)驗(yàn)

流動相：甲醇；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：50 μL；運(yùn)行時間：0.1 min；連續(xù)進(jìn)樣次數(shù)：6 次。

1.2.2 進(jìn)樣殘留實(shí)驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：100 μg／mL 萘-甲醇溶液；流動相：100%甲醇，流速為1.0 mL／min；色譜柱：C18色譜柱；檢測器：紫外可見光（或二極管陣列）檢測器；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.2.3 進(jìn)樣重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

同1.2.2。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 進(jìn)樣體積誤差

在2 mL 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣小瓶中加入約1.5 mL 經(jīng)脫氣的一級水，用聚四氟乙烯（或者預(yù)切縫）的隔墊密封小瓶，使用小鉗子或者戴手套稱量小瓶，記錄質(zhì)量W1(g)。按照1.2.1 建立檢測序列。序列完成后，使用小鉗子或者戴手套稱量小瓶，記錄質(zhì)量W2(g)。自動進(jìn)樣器的進(jìn)樣體積誤差按公式（1）計(jì)算：

1.3.2 進(jìn)樣重復(fù)性

建立檢測序列：共進(jìn)樣7 次，其中A（流動相空白）進(jìn)樣1 次，B（萘-甲醇溶液）進(jìn)樣6 次。自動進(jìn)樣器的進(jìn)樣重復(fù)性計(jì)算方法：對萘-甲醇溶液的6 次分析譜圖進(jìn)行積分，分別得到相應(yīng)的峰面積和峰高，計(jì)算6 個色譜峰的峰面積和6 個峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于1.0%，峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%［7］。

1.3.3 進(jìn)樣殘留

建立檢測序列：共進(jìn)樣2 次，其中A（萘-甲醇溶液）進(jìn)樣1 次，B（流動相空白）進(jìn)樣1 次。對萘-甲醇溶液和流動相空白的2 次分析譜圖進(jìn)行積分，分別得到相應(yīng)的色譜峰峰面積和峰高，計(jì)算空白溶液的響應(yīng)值（面積或峰高）與萘-甲醇溶液響應(yīng)值（面積或峰高）的比值。空白與萘-甲醇溶液峰面積比值應(yīng)不大于0.2%，峰高比值應(yīng)不大于0.4%［7］。

1.4 注意事項(xiàng)

在進(jìn)樣針頭為塑料時使用預(yù)切縫的隔墊是為了避免在連續(xù)進(jìn)樣中產(chǎn)生真空，進(jìn)樣針使用鋼針頭時則不必使用預(yù)切縫的隔墊。使用水作稱量介質(zhì)，是因?yàn)樗拿芏仍谑覝?0～25℃范圍內(nèi)體積變化很小。稱量時應(yīng)使用萬分之一或者十萬分之一的電子天平。如果進(jìn)樣體積小于50 μL，進(jìn)樣次數(shù)至少要大于10 次。

實(shí)驗(yàn)方法中的參考值均是依據(jù)儀器制造商對儀器進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證時的技術(shù)要求給出的。在儀器工作狀況良好時，經(jīng)過對上述3 項(xiàng)進(jìn)行檢測，相關(guān)指標(biāo)確實(shí)可以達(dá)到。

2 進(jìn)樣體積誤差不確定度來源及評定

2.1 數(shù)學(xué)模型

自動進(jìn)樣器進(jìn)樣體積誤差可以表示為：

根據(jù)公式（2），自動進(jìn)樣器進(jìn)樣體積誤差ΔX的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(ΔX設(shè)定)=u(X實(shí)測)。

2.2 測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1

選擇進(jìn)樣重復(fù)性中的最大參考值2.0%［7］，進(jìn)樣6 次（n=6），則：

2.3 稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 2

根據(jù)天平的檢定證書得知天平為I 級，最大允許誤差±0.5 mg（量程為0～50 g），則：

2.4 溫度波動導(dǎo)致水體積變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3

在室溫20～25℃范圍內(nèi)，水的密度隨溫度變化而引起的體積變化為0.3%［7］，即u3=0.3%。

2.5 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由于各分量的不確定度互不相關(guān)，所以自動進(jìn)樣器進(jìn)樣體積誤差ΔX 相對合成不確定度為：

2.6 相對擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2，被檢測自動進(jìn)樣器的進(jìn)樣體積誤差的擴(kuò)展不確定度為：

2.7 說明

由于進(jìn)樣重復(fù)性的測量結(jié)果是進(jìn)樣體積誤差的一個不確定度分量，而進(jìn)樣殘留的測量結(jié)果實(shí)質(zhì)上只是空白和標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積（或峰高）的一個比值，所以沒有對這兩項(xiàng)做不確定度分析，只對進(jìn)樣體積誤差進(jìn)行了不確定度的分析。

3 評定案例

根據(jù)上述方法對中國食品藥品檢定研究院29臺液相色譜儀的自動進(jìn)樣器進(jìn)行校準(zhǔn)，結(jié)果顯示28臺設(shè)備自動進(jìn)樣器合格，1 臺設(shè)備自動進(jìn)樣器進(jìn)樣體積重復(fù)性（RSDA）為1.5%（＞1.0%），具體情況見表1。

4 結(jié)語

通過建立液相色譜儀自動進(jìn)樣器的校準(zhǔn)方法及不確定度評定，可以有效檢驗(yàn)液相色譜儀的工作狀態(tài)，提高檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，值得推廣使用。

表1 液相色譜自動進(jìn)樣器進(jìn)樣重復(fù)性測定結(jié)果

［1］ 孫會敏.高效液相色譜法簡介及其在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用［J］.齊魯藥事，2011，30(11): 38-42.

［2］ 葉顯撐,范國榮,祝德秋.液-質(zhì)聯(lián)用在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31(4): 317-319.

［3］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［4］ JJG 705-2002 液相色譜儀［S］.

［5］ 王冠杰，楊洋，肖鏡.WHO 藥品預(yù)認(rèn)證對液相色譜儀性能驗(yàn)證的要求及比較分析［J］.中國藥事，2013，27(5): 504-507.

［6］ 王家威.世界衛(wèi)生組織藥品預(yù)認(rèn)證項(xiàng)目的概述及發(fā)展方向［J］.中國藥事，2009，23(4): 390-392.

［7］ OMCL Network of the Council of Europe. Quality Management Document PA/PH/OMCL (11) 04- Annex 1［S］.