HPLC 法測定茶葉中兒茶素及咖啡堿*

周順珍，龔雪，周國蘭，郭燦，鄭文莉

（貴州省茶葉研究所，貴陽 550006）

茶葉中所含的多酚類物質(zhì)是一種以兒茶素為主體的酚類化合物，是茶多酚的主體成分，兒茶素約占茶多酚總量的65%～80%,主要包括沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素（EC）、兒茶素（+C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子基兒茶素沒食子酸酯（GCG）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）等。開發(fā)和利用天然抗氧化劑已經(jīng)成為當今世界食品藥品科技發(fā)展的方向。兒茶素作為一種重要的抗氧化劑，主要用于抗癌、抗腫瘤、清除人體自由基，還可用于防止齲齒、抑菌等。研究發(fā)現(xiàn)EGCG 在體內(nèi)外對許多腫瘤細胞增殖具有抑制作用［1］。目前測定兒茶素組分的首選方法為高效液相色譜（HPLC）法［2–6］。我國現(xiàn)行檢測茶葉中兒茶素組分及咖啡堿（CAF）的最新國家標準GB／T 8313–2008［7］也是HPLC 法，該法采用甲醇多次提取法對樣品進行前處理，操作繁瑣，流動相組成復(fù)雜，樣品分析時間過長，所需試劑和儀器多且昂貴。

筆者采用水提法進行樣品浸提，并與GB／T 8313–2008 進行比較，結(jié)果表明所建立的方法操作簡單，成本低，效率高，使用范圍廣，能同時測定7 種兒茶素組分及咖啡堿，效果較好。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent1260 型，美國安捷倫科技有限公司；

電子天平：BSA224S–CW 型，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HH·SY21–Ni8 型，北京長源實驗設(shè)備廠；

抽濾裝置：2XZ–0.5 型，浙江黃巖黎明實業(yè)公司；

超純水制備器：TST–RO–20 型，石家莊泰斯特儀器設(shè)備有限公司；

數(shù)控超聲清洗器：KQ5200DE 型，昆山市超聲儀器有限公司；

離心機：TGL–20bR 型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

快速混勻器：SK–1 型，金壇市杰瑞爾電器有限公司；

甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、乙睛：均為色譜純；

乙酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、抗壞血酸：均為分析純；

GA，CAF，EGC，+C，EC，EGCG，GCG，ECG混合對照品：國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心／教育部茶學(xué)重點實驗室；

各兒茶素組分及咖啡堿對照品：純度均不小于98%，北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司；

實驗用水為純凈水。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35℃；紫外檢測器波長：278 nm ；流動相：A 相（超純水），B 相（N,N-二甲基甲酰胺︰甲醇︰冰乙酸=40︰2︰1.5）；流動相流速：1.0 mL／min；進樣量：5 μL。

1.3 對照品溶液的配制

精 密 稱 取GA，CAF，EGC，+C，EC，EGCG，GCG，ECG 混合對照品適量，加純凈水配制成分別含9.71 μg／mL GA，101.97 μg／mL CAF，81.09 μg／mL EGC，7.35 μg／mL +C，64.23 μg／mL EC，400.16 μg／mL EGCG，7.27 μg／mL GCG，91.83 μg／mL ECG 的混合對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備

取部分水提取液（GB／T 8305–1987）［8］過0.45 μm 水系微孔濾膜。在1.2 色譜條件下進行測定。采用保留時間識別各目標組分，以外標法確定相應(yīng)組分的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

在1.2 色譜條件下取供試品溶液5 μL 進樣，記錄色譜圖。GB／T 8305–1987 水提取法色譜圖如圖1 所示。

圖1 本法供試品色譜圖

按照GB／T 813–2008 甲醇提取法進行樣品處理后進樣分析（不含GCG），供試品的色譜圖如圖2 所示。圖2 表明，甲醇提取法樣品中的EGCG 與EC 不能有效分離。

圖2 國標方法供試品色譜圖

2.2 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

分別精密吸取混合對照品溶液2.5，5.0，7.5，10，12.5 和15 μL［9］，按1.2 色譜條件進樣測定，同一體積的樣品平行分析3 次，取其平均值。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μL）為橫坐標作圖，得到各組分的線性回歸方程如表1。由表1 可知，當對照品溶液進樣量在2.5～15 μL，GA，CAF，EGC，DL-C+C，EC，EGCG，GCG 和ECG 8 種組分的進樣量分別在0.024 3～0.145 6，0.254 9～1.529 6，0.202 7～1.216 4，0.018 2～0.110 2，0.160 6～0.963 4，1.000 4～6.002 4，0.018 2～0.109 0，0.229 6～1.377 4 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為0.991 0～0.999 9。

表1 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.3 加標回收率及精密度

吸取9 份已知含量的綠茶提取液各1 mL，分為3 組，每組3 份。分別加入混合對照品溶液0.5，1.0，1.5 mL，按實驗方法進行測定，計算GA，CAF，ECG，+C，EC，EGCG，GCG 和ECG 的含量，計算各組分的回收率及精密度，結(jié)果見表2。由表2可知，所有組分的回收率在98.60%～100.17%之間，測定結(jié)果的相對標準偏差（RSD)均小于0.48%，說明該方法重現(xiàn)性良好，檢測結(jié)果可靠，滿足檢測要求。

表2 回收率及精密度試驗結(jié)果（n=3）

2.4 樣品測定

取同一批號樣品6 份，分別在1.2 色譜條件下及按照國標方法進行6 次平行測定，取平均值作為測定結(jié)果，見表3。

由表3 可知，與現(xiàn)行標準方法相比，水提取法測定結(jié)果的相對偏差在0.47%～5.55%之間。另外，水提法有部分脂溶性兒茶素不能完全溶出，而GB／T 8313–2008 甲醇提取法EGC，EGCG 和ECG 的含量相對較高；GA 和+C 測定結(jié)果差別不大，在誤差范圍內(nèi)；用70%的甲醇溶液提取，雖然提取完全，但提取液中含有大量的葉綠素，進行液相色譜檢測時泵壓明顯增大，對色譜柱污染嚴重，使柱壽命縮短；甲醇提取法樣品中的EGCG 和EC 不能分離，對色譜柱的要求較高；甲醇提取法操作也較繁瑣，有機溶劑用量較大，不利于環(huán)保和節(jié)約成本。用水提取樣品不僅能達到較好的提取效果，且可以直接利用水浸出物的提取液，無需重新浸提，步驟簡便，成本較低。

表3 兩種提取方法的測定結(jié)果（n=6） %

3 結(jié)語

用水浸出方式提取綠茶樣品，HPLC 法測定茶葉中的兒茶素和咖啡堿，操作簡便，結(jié)果準確。

［1］ Milligan S A，Burke P，Coleman D T，et al. The green tea polyphenol EGCG potentiates the antiproliferative activity of Met and epidermal growth factor receptor inhibitors in nonsmall cell lung cancer cells［J］. Clin Cancer Res，2009，15(15): 4 885–4 894.

［2］ 鄧永亮，馮雷，呂有才.一種快速檢測茶葉中兒茶素的HPLC 方法［J］.西南農(nóng)業(yè)黨學(xué)報，2011，24(3): 932–935.

［3］ 侯冬巖，回瑞華，李鐵純.高效液相色譜法對綠茶中茶多酚含量測定［J］.食品科學(xué)，2010，31(24): 307–307.

［4］ 何昱，洪筱坤，五智華.HPLC 法測定茶葉中兒茶素類咖啡因的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27(2): 197–200.

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［7］ GB／T 8313–2008 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法［S］.

［8］ GB／T 8305–1987 茶水浸出物測定［S］.

［9］ 劉臣，張雷，劉婧，等，反相高效液相色譜法同時測定碧螺春茶中4種兒茶素類化合物及咖啡因含量［J］.安微農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(12): 7 425–7 427.