多種生姜有效成分聯(lián)合提取工藝*

高曉東，王秋英，喬旭光，李鋒，唐曉珍

1(山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東泰安，271018)

2(山東省科學技術(shù)干部學校，山東濟南，250100)

生姜是我國的傳統(tǒng)優(yōu)勢和特色資源之一，在國際市場上占有非常重要的地位。我國生姜生產(chǎn)歷史悠久，品質(zhì)優(yōu)良，但其產(chǎn)后加工技術(shù)水平比較低，多以原料的形式參與國際市場競爭，嚴重制約了我國生姜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，迫切需要高附加值的深加工產(chǎn)品來提升我國生姜深加工整體技術(shù)水平。

目前，生姜中已研究的主要成分有姜辣素、姜黃素以及生姜蛋白酶。姜辣素是生姜呈多種藥理作用的主要功能因子［1］，能清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等功能［2-3］。姜黃素是植物界很稀少的具有二酮的色素，具有降糖、降脂、抗氧化、抗炎、抗癌等藥理作用［4-6］。生姜蛋白酶被認為是木瓜蛋白酶家族的新成員［7］，是一種非常有工業(yè)化應用前景的蛋白酶，可用于肉類嫩化［8］、酒類澄清［9］，凝乳［10］、大豆分離蛋白［11］等，尤其能特異水解脯氨酸P2位含有脯氨酸的多肽和蛋白質(zhì)，這種對脯氨酸的特殊親和性使其在生化研究中成為一種很有前途的工具酶［12］。

生姜中各種有效成分具有較高的研究和應用價值，其提取分離的新工藝也不斷發(fā)展，但多數(shù)都只是單獨提取。本實驗針對目前生姜中各種有效成分多為單獨提取的現(xiàn)狀，在綜合各種生姜有效成分提取方法的基礎(chǔ)上，對生姜多種有效成分的聯(lián)合提取方法進行研究，以確定一次性提取生姜蛋白酶、姜黃素和姜辣素的適宜工藝，從而可充分利用生產(chǎn)原料，降低生產(chǎn)成本和時間，提高生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

萊蕪大姜:由山東省萊蕪市東興源食品有限公司提供。

1.2 試驗儀器

UV-2501PC型紫外-可見分光光度計，日本島津公司;BS-150A電子天平，上海友聲衡器有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇常州國華電器有限公司;酸度計，美國Thermo公司;TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHZ-ⅢD型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠;85-2型磁力攪拌器，鄭州市亞榮儀器有限公司。

1.3 試驗試劑

酪氨酸，無錫晶海氨基酸有限公司;香草醛，杭州中香化學有限公司;L-半胱氨酸、酪蛋白，美國Sigma公司;三氯乙酸，上海山浦化工有限公司;無水乙醇、NaOH、NaH2PO4、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉，天津市凱通化學試劑有限公司;Na2HPO4，天津市巴斯夫化工有限公司;H3PO4，上海中秦化學試劑有限公司;所用試劑均為分析純。

1.4 實驗方法

1.4.1 料液比的選擇

取生姜100 g，用無水乙醇按料液比 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5(g∶mL)打漿，低溫靜置冷卻后，離心 5 min(轉(zhuǎn)速3 000 r/min)，測定上清液中姜辣素與姜黃素的含量和沉淀中生姜蛋白酶的比活力，綜合確定最佳料液比。

1.4.2 上清液的處理

1.4.2.1 旋蒸溫度的選擇

將無水乙醇打漿后的上清液加入旋蒸瓶，并按照40、50、60、70、80℃的梯度進行真空旋蒸，記錄旋蒸時間，旋蒸后，上相餾分為姜辣素，測定其Abs 280 nm值，下相固體物為姜黃素，測定其Abs 425 nm值，確定最佳提取溫度。

1.4.2.2 旋蒸轉(zhuǎn)速的選擇

在1.4.2.1確定的旋蒸溫度下，分別按照16、32、48、64、80 r/min 的轉(zhuǎn)速進行真空旋蒸，同樣根據(jù)吸光度值確定旋蒸的最佳轉(zhuǎn)速。

1.4.3 沉淀的處理

1.4.3.1 緩沖液pH值的選擇

離心后的沉淀分別用 pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的 H3PO4緩沖液(0.05 mol/L，含 5 mmol/L EDTA，15 mmol/L L-Cysteine)按照 1∶4(g∶mL)進行復溶，攪拌混勻后過濾，棄殘渣留上清液，測量清液體積，置清液于冰浴中，緩慢加入95%無水乙醇，使乙醇的終體積分數(shù)為60%，于冰浴中靜置沉淀后，抽濾，稱量沉淀質(zhì)量，得濕酶粉。于4℃冰箱保存。測定酶活時，以濕酶粉∶∶檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(0.05 mol/L、pH 6.0)=1∶10(g∶mL)的比例混合，待酶粉溶解完全，即得到酶液，根據(jù)比活力確定最佳緩沖液pH值［13］。酶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.3.2 冰浴時間的選擇

根據(jù)1.4.3.1中確定的緩沖液pH值，重復以上操作，于冰浴中分別靜置4、5、6、7、8 h 沉淀后，抽濾，稱量沉淀質(zhì)量，得濕酶粉，根據(jù)比活力確定最佳冰浴時間。

1.5 測定方法

1.5.1 生姜蛋白酶比活力的測定方法［14］

生姜蛋白酶比活力即生姜蛋白酶活力與總蛋白質(zhì)含量的比值，單位U/mg。

1.5.1.1 蛋白質(zhì)含量的測定

本實驗采用Bradford Protein Assay(考馬斯亮藍G-250)法測定蛋白質(zhì)濃度［14］。標準曲線方程為:y=97.142x-1.2932，R2=0.997，其中:x為樣品的吸光度值(Abs 595nm);y為蛋白質(zhì)濃度(μg/mL)。

1.5.1.2 生姜蛋白酶活力測定

生姜蛋白酶活力的定義:在40℃水浴條件下，酶促反應前5 min降解酪蛋白產(chǎn)生TCA(三氯乙酸)可溶的多肽增加量，以活性與滅活的生姜蛋白酶進行對照，根據(jù)酪氨酸標準方程，每增加1 μg/mL酪氨酸的值計量為一個酶活力單位。標準曲線方程為:y=802.92x-9.5212，R2=0.9995，其中:x為酶促反應樣品的吸光度值(Abs 280nm);y為生姜蛋白酶活力值(U)［14］。

1.5.2 姜辣素含量的計算［15］

準確配制20 μg/mL的香草醛標準溶液，測得標準曲線方程為:y=12.946x+0.208，R2=0.999 1，其中:x為樣品的吸光度值(Abs 280 nm);y為姜辣素含量(μg/mL)。姜辣素質(zhì)量計算:

其中:m為姜辣素質(zhì)量(mg);V0為上清液的體積(mL);V1為所取旋蒸液的體積(mL);V2為旋蒸出的姜辣素的體積(mL)。

1.5.3 姜黃素含量的計算［16］

準確配制100 μg/mL的姜黃素標準溶液，測得標準曲線方程為:y=6.346 9x-0.303，其中:x為樣品的吸光度值(Abs 425 nm);y為姜黃素含量(μg/mL)。姜黃素質(zhì)量計算:

其中:m為姜黃素質(zhì)量(mg);V0為上清液的體積(mL);V1為所取旋蒸液的體積(mL);V2為加入姜黃素的乙醇的體積(mL)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，實驗結(jié)果均為3次結(jié)果的平均值。差異分析采用Ducan法進行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳料液比的確定

由圖1、圖2可見，當料液比小于1∶3(g∶mL)時，隨著料液比的增加，姜辣素、姜黃素的提取率以及生姜蛋白酶的比活力呈上升趨勢，原因可能是在溶劑較少的情況下，打漿比較完全，成分溶出較多;而當料液比超過1∶3后，各指標隨料液比的增加而降低，這是因為無水乙醇在打漿過程中起到沉淀蛋白質(zhì)(包括酶)、浸提姜黃素等脂溶性物質(zhì)的作用，無水乙醇用量的增加，一方面可以保證細胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，使生姜蛋白酶充分沉淀，另一方面也會增加生姜蛋白酶變性失活的幾率［13］。料液比為1∶3時，極顯著(P＜0.01)高于其他料液比，故選為最佳料液比。

圖1 生姜蛋白酶比活力隨料液比的變化Fig.1 Ginger proteas activity with the materials liquid radio changes

圖2 姜辣素、姜黃素質(zhì)量隨料液比的變化Fig.2 Gingerol and Curcumin quality with the material liquid radio changes

2.2 最佳旋蒸溫度的確定

由圖3可以看出，姜辣素、姜黃素的提取率都隨溫度增加而顯著升高(P＜0.05)，60℃時達到最高，隨后姜黃素提取率緩慢下降(P＞0.05)，而姜辣素極顯著降低(P＜0.01)，可見最佳旋蒸溫度為60℃。

圖3 旋蒸溫度對姜辣素、姜黃素質(zhì)量的影響Fig.3 Rotary evaporation temperature of Gingerol and Curcumin quality influence

2.3 最佳轉(zhuǎn)速的確定

根據(jù)圖4所示，姜辣素、姜黃素的提取率隨轉(zhuǎn)速的增加均呈降低趨勢，可能是因為轉(zhuǎn)速越大，旋蒸時間越短，收集不充分，導致測量值有所下降。同時本實驗采用N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，最低轉(zhuǎn)速為16 r/min，且在企業(yè)實際生產(chǎn)中旋轉(zhuǎn)速度越高消耗成本越多，故確定最佳轉(zhuǎn)速為16 r/min。

圖4 旋蒸轉(zhuǎn)速對姜辣素、姜黃素質(zhì)量的影響Fig.4 Rotary evaporation speed of Gingerol and Curcumin quality influence

2.4 緩沖液pH值對生姜蛋白酶比活力的影響

由圖5可見，生姜蛋白酶的比活力隨復溶緩沖液pH值的增加而極顯著升高(P＜0.01)，pH=6.5時達到最高，且極顯著高于其他pH值(P＜0.01)，然后隨著pH值的增加逐步降低，這可能是由于磷酸緩沖液復溶后的pH值過高或過低破壞了生姜蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，并引起酶構(gòu)象的改變，導致酶活力降低［17］。故最佳緩沖液pH值為6.5。

圖5 生姜蛋白酶比活力隨緩沖液pH值的變化Fig.5 Ginger protease activity with buffer solution pH value changes

2.5 冰浴時間對生姜蛋白酶比活力的影響

圖6 顯示，當冰浴時間低于5 h時酶產(chǎn)量很低，冰浴5h時生姜蛋白酶比活力最高，且顯著高于其他時間(P＜0.05)，之后呈下降趨勢。原因可能是由于冰浴過程中乙醇使蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變或破壞，即蛋白質(zhì)變性，使其理化性質(zhì)改變和生物活性喪失，從而導致酶比活力降低［12］。所以最佳冰浴時間為5 h。

2.6 正交實驗

圖6 生姜蛋白酶比活力隨冰浴時間的變化Fig.6 Ginger protease activity with ice bath time changes

2.6.1 生姜蛋白酶L9(34)正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選定生姜蛋白酶比活力正交實驗的因素及水平如表1所示，正交實驗表及結(jié)果如表2所示。

表1 生姜蛋白酶最佳提取方案因素水平表Table 1 The best extraction scheme of Ginger protease factor level table

表2 生姜蛋白酶L9(34)正交實驗結(jié)果Table 2 Ginger protease L9(34)orthogonal experimental results

由表2極差分析結(jié)果可知，各因素對比活力的影響大小依次是A料液比＞D冰浴時間＞C緩沖液pH，最佳條件為 A2C2D2，即料液比1∶3，緩沖液最佳pH值為6.5，最佳冰浴時間為7 h，經(jīng)驗證生姜蛋白酶的得率為1.376%，比活力可達4 465 U/mg，大于正交表中最大值4 383 U/mg。

2.6.2 姜辣素、姜黃素L9(34)正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選定姜辣素和姜黃素提取的正交實驗因素及水平如表3，正交實驗表及結(jié)果如表4所示。

表3 姜辣素、姜黃素最佳提取方案因素水平表Table 3 Gingerol and Curcumin extraction scheme factor level table

表4 姜辣素、姜黃素L9(34)正交實驗結(jié)果Table 4 Gingerol and Curcumin L9(34)orthogonalexperimental results

由表4極差分析結(jié)果可知，各因素對提取率影響大小均依次為A料液比＞D'轉(zhuǎn)速＞C'旋蒸溫度，最佳條件為A3C'2D'1，即料液比1∶4，旋蒸溫度60℃，轉(zhuǎn)速16 r/min。在此條件下所得提取液的姜辣素、姜黃素質(zhì)量與表4中實驗9一致，每100 g分別為334.8 mg和409.3 mg，其提取率分別為0.334 8%和0.409 3%。由于姜辣素、姜黃素的R值較小，且生姜蛋白酶的市場價值與前兩種成分相比更高，綜合考慮實驗結(jié)果最終確定生姜中3種有效成分同步提取的最佳條件為A2C2D2C'2D'1，即料液比1∶3，生姜蛋白酶提取的緩沖液pH為6.5，冰浴時間7h;姜辣素、姜黃素旋蒸溫度60℃，轉(zhuǎn)速16 r/min。在此條件下姜辣素、姜黃素的提取率分別為0.314 3%、0.388 9%，與最佳條件下提取率無顯著差異。

3 結(jié)論

生姜中3種有效成分同步提取的最佳條件為A2C2D2C'2D'1，即料液比1∶3(g∶mL)，生姜蛋白酶提取的緩沖液pH值為6.5，冰浴時間7 h;姜辣素、姜黃素旋蒸溫度60℃，轉(zhuǎn)速16 r/min。此條件下生姜中姜辣素、姜黃素的提取率分別為0.314 3%、0.388 9%;生姜蛋白酶的得率為1.376%，比活力達到4 465 U/mg。

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