液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜法同時測定蟲生真菌菌絲中16種游離氨基酸*

劉肖肖，李淑林，陸瑞利，羅飛飛，胡豐林

1(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥，230036)

2(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系，安徽合肥，230036)

蟲生真菌(entomogeneous fungi)是一種以昆蟲為寄主的內(nèi)生真菌，具有有性型和無性型兩種存在形式。蟲草屬中的冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)和蛹蟲草(Cordyceps militaris)以及它們的無性型中國被毛孢(Hirsutella sinensis)和蛹擬青霉(Paecilomyces militari)［1-2］已被廣泛地用于保健食品和藥品［3-4］。目前關(guān)于蟲草及其無性型的研究主要集中在甘露醇、核苷、多糖、抗氧化和抗腫瘤等活性成分［5-7］，而缺乏對蟲草及其無性型中的游離氨基酸組成的系統(tǒng)研究。游離氨基酸是食品中可以被人體直接吸收的重要營養(yǎng)物質(zhì)，同時又是食品中主要的風(fēng)味物質(zhì)，因此，測定蟲草及其無性型中各種游離氨基酸的含量，將可作為評價該類真菌的食用和保健價值的重要指標(biāo)。

由于多數(shù)氨基酸不具有紫外吸收和熒光檢測的發(fā)色基團(tuán)，所以當(dāng)用傳統(tǒng)的液相色譜或氨基酸分析儀測定氨基酸含量時，首先要對氨基酸進(jìn)行衍生化處理，分析過程較復(fù)雜［8］，同時衍生化處理容易形成非目標(biāo)衍生物，從而影響氨基酸測定的準(zhǔn)確性。相比較而言，近年來應(yīng)用越來越普及的液相色譜與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［9-10］，具有較高的分辨率和檢測的靈敏度，對樣品的檢測限可以達(dá)到納克級，遠(yuǎn)高于普通的HPLC方法;同時能夠?qū)悠分刑囟ńM分單獨(dú)提取分析，可有效地避免在HPLC上出現(xiàn)的重疊峰的干擾;樣品無需進(jìn)行衍生化處理，實(shí)驗(yàn)過程簡單，準(zhǔn)確性高，然而目前尚無以之對蟲生真菌中游離氨基酸進(jìn)行分析檢測的報道。因此，本文擬采用液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜(LC-ESI-TOF-MS)聯(lián)用分析法，建立一種簡捷，高效及高靈敏度的測定蟲生真菌中游離氨基酸含量的方法，為蟲生真菌中游離氨基酸的檢測、資源利用和食用質(zhì)量評價提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 供試菌株

中國被毛孢(Hirsutella sinensis)菌株號為RCEF5042;蛹擬青霉(Paecilomyces militari)菌株號為RCEF0720;古尼擬青霉(Paecilomyces gunnii)菌株號為RCEF0199;蟬棒束孢(Isaria cicadae)菌株號為RCEF4777;細(xì)腳棒束孢(Isaria tenuip)菌株號為RCEF4256;戴氏綠僵菌(Metarhizikum taii)菌株號為RCEF4127;粉被瑪利亞霉(Mariannaea puinosa)菌株號為RCEF4695，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)蟲生真菌研究中心提供。

1.1.2 材料與試劑

色譜純甲醇，色譜純乙腈，色譜純甲酸，均購于美國Tedia公司;16種氨基酸(分析純):脯氨酸(Pro)，纈氨酸(Val)，亮氨酸(Leu)，異亮氨酸(Ile)，賴氨酸(Lys)，甲硫氨酸(Met)，組氨酸(His)，苯丙氨酸(Phe)，精氨酸(Arg)，酪氨酸(Tyr)，色氨酸(Try)，絲氨酸(Ser)，蘇氨酸(Thr)，胱氨酸(Cys)，天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，購于中國藥品生物制品鑒定所。

1.1.3 主要儀器

高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析儀(Agilent 6210 time of flight LC/MS)，包括 Agilent1100高效液相色譜(HPLC)，二極管陣列檢測器(DAD)，飛行時間質(zhì)譜儀(TOF)和電噴霧離子源(ESI)，購于美國Agilent公司;供試分析型高效液相色譜柱有Agilent Eclipse XDB-C18(2.1 mm ×150 mm，5μm)、Waters Xterra MS C18(2.1 mm ×150 mm，3.5μm)和 Phenomenex Synergi Hydro-RP(4.6mm ×250mm，4μm)，分別購于Agilent、Waters和 Phenomenex公司;AN0635 電子天平，購于上海民橋精密科學(xué)儀器公司;FreeZone12冷凍干燥系統(tǒng)，購于美國Labonconco公司;2K-15超速離心機(jī)，購于Sigma公司;KQ5 200DE型數(shù)控超聲波清洗器，購于昆山市超聲儀器有限公司;SimplicityRUV超純水系統(tǒng)，購于Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

精確稱取16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于30%的甲醇水溶液，分別得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ(含脯氨酸(Pro)，纈氨酸(Val)，亮氨酸(Leu)，異亮氨酸(Ile)，賴氨酸(Lys)，甲硫氨酸(Met)，苯丙氨酸(Phe)和精氨酸(Arg)，它們的濃度均為500 μmol/L);混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ(含絲氨酸(Ser)，蘇氨酸(Thr)，胱氨酸(Cys)，組氨酸(His)，天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Try)，它們的濃度均為125 μmol/L)。這些標(biāo)樣在測定前用30%的甲醇水溶液(含0.1%甲酸)稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

1.2.2 樣品前處理

精確稱取各蟲生真菌固體培養(yǎng)菌絲體的凍干粉200 mg，溶于4 mL 30%的甲醇水溶液(含0.1%甲酸)，25℃超聲提取30 min，1 2000 r/min離心10 min取上清液，即得50 mg/mL的待測樣品溶液。制備好的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液在4℃暫存?zhèn)溆?，保存時間不得超過 24 h［10-11］。

1.2.3 色譜條件

進(jìn)樣體積:5 μL;流速:0.60 mL/min;柱溫箱:25℃;供試流動相體系為含0.1%甲酸的甲醇水體系和乙腈水體系，采用梯度洗脫，洗脫梯度為:0～8 min由100%的流動相A(水相)洗脫;8～15 min流動相B(有機(jī)相)比例由0%增加到15%;15～23 min流動相B由15%增加到20%;23～30 min流動相B由20%增加到50%。

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧(ESI)離子源的霧化氣壓:0.24 MPa(35psi);氮?dú)饬魉?12.0 L/min;毛細(xì)管溫度:325℃;離子掃描范圍(m/z):50～1000;陰離子模式下離子化電壓:3 500 V;碎片電壓:175 V;陽離子模式下離子化電壓:4 000 V;碎片電壓:250 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱及色譜條件初步選擇

由于氨基酸是極性較強(qiáng)的化合物，因此初步選擇了3個適合極性化合物分析的高效液相色譜柱進(jìn)行初步比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)以Phenomenex Synergi Hydro-RP色譜柱，以乙腈水為流動相時分離效果最好。具體流動相條件為:A相為0.1%甲酸水溶液;B相為0.1%甲酸乙腈溶液;流動相梯度為:0～8 min用100%A相洗脫;8～15 min B相由0%增加到15%;15～23 min B相由15%增加到20%;23～30 min B相由20%增加到50%。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

實(shí)驗(yàn)分別測定了16種氨基酸在陽離子模式和陰離子模式下的電離情況，結(jié)果顯示:16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品在陽離子模式下的主要離子碎片為脫羧基、脫氨基和脫水后形成的離子，即［M-HCOOH+H］+、［MH2O+H］+或［M-NH3+H］+;同時，含支鏈氨基酸的支鏈會發(fā)生不同程度的斷裂，芳香類氨基酸還會產(chǎn)生多種苯基離子碎片，離子種類較復(fù)雜，不利于定量分析。而在陰離子模式下，16種氨基酸的離子碎片主要為準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-，離子碎片專一，穩(wěn)定性高，增加了檢測的靈敏度和定量范圍，可見采用陰離子分析模式較好。

陰離子模式下測定的16種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 16種氨基酸在陰離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectra data of 16 amino acids detected under negative ionization mode

2.3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的定性及定量分析

2.3.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的定性分析

在陰離子模式下，將16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液單獨(dú)進(jìn)樣得到各種氨基酸準(zhǔn)確的質(zhì)譜圖(見圖1)。根據(jù)質(zhì)譜圖提供的離子碎片，可確定各氨基酸最優(yōu)的定量離子均為準(zhǔn)分子離子峰(見表1)。雖然亮氨酸和異亮氨酸具有相同的分子離子，但亮氨酸和異亮氨酸的出峰時間不同，先出峰為異亮氨酸，據(jù)此可對二者進(jìn)行準(zhǔn)確分析。此外，纈氨酸的準(zhǔn)分子離子(m/z)為116.072與色氨酸的吲哚基離子(m/z:116.050)質(zhì)荷比接近，但二者的色譜保留時間不同，因此可準(zhǔn)確區(qū)分。總之，在陰離子模式下16種氨基酸都可以達(dá)到定量測定的要求。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中提取的16種氨基酸的離子流圖如圖2所示。

圖1 陰離子模式下16種氨基酸的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of 16 amino acids detected under negative ionization mode

2.3.2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的定量分析

將2.1中配置的氨基酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按相應(yīng)的質(zhì)譜條件依次進(jìn)樣測定峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(μmol/L)為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得16種氨基酸的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(見表2)。根據(jù)樣品中16種氨基酸含量的差異，對各種氨基酸的線性范圍進(jìn)行了優(yōu)化，從而得到最優(yōu) 的回歸方程和最佳測定濃度(見表2)。

圖2 陰離子模式下氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中16種氨基酸的離子流圖Fig.2 Ion flow of 16 amino acids detected under negative ionization mode

表2 16種氨基酸的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)，RSD及回收率的測定結(jié)果Table 2 Linear regression equation，coefficient of correlation，RSD and recovery ratio of the 16 amino acids

2.4 精密度測定

精確配制濃度為50 μmol/L的16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，按相同的質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算峰面積，求得16種氨基酸的的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.84% ～2.75%之間(見表2)。

2.5 回收率測定

準(zhǔn)確配制25 mg/mL的細(xì)腳棒束孢樣品溶液，加入適量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，按與試驗(yàn)樣品相同的方法測定峰面積，求得16種氨基酸的回收率為97.1%-102.8%(見表2)。

表3 7種蟲生真菌樣品中16種游離氨基酸的含量Table 3 Contents of 16 amino acids of the seven tested entomogenous fungi

2.6 7種蟲生真菌樣品中16種游離氨基酸含量的分析

按照前面優(yōu)化的方法，對7種蟲生真菌菌絲樣品中16種游離氨基酸的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見表3。從表中可以看出，同一菌株中各種氨基酸的含量相差較大，但所有菌株中含量最高的均為苯丙氨酸，其中，中國被毛孢的苯丙氨酸含量最高為2.173 mg/g;各菌株中胱氨酸的含量均很低，在最低線性濃度外;各菌株中脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、賴氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)和苯丙氨酸(Phe)含量基本在0.3 mg/g以上，較其他氨基酸含量明顯較高，它們和苯丙氨酸一起可作為蟲生真菌中游離氨基酸的特征指標(biāo)。不同菌株間同種氨基酸含量也存在一定差異，對于含量最高的苯丙氨酸在不同菌株間的含量差異為0.718～2.173 mg/g;絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)在戴氏綠僵菌中的含量明顯高于其他菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，不同菌株間游離氨基酸總含量也存在較大差異，中國被毛孢中游離氨基酸總含量為7.537 mg/g，較蟬擬青霉(3.196 mg/g)的總含量高出1.36倍。

3 結(jié)論

本文采用液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜(LCTOF-MS)聯(lián)用技術(shù)，在陰離子電離模式下，可快速地對16種氨基酸進(jìn)行定性和定量測定。16種氨基酸的色譜特征和質(zhì)譜離子特征明顯，可準(zhǔn)確定性。定量試驗(yàn)結(jié)果表明，16種氨基酸的線性范圍廣準(zhǔn)確性高，在相關(guān)系數(shù)大于0.998時，線性范圍都能達(dá)到4.0～125 μmol/L，最大可達(dá)2.0 ～500 μmol/L;在氨基酸濃度為50 μmol/L時，16種氨基酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.84% ～2.75%之間;回收試驗(yàn)結(jié)果顯示，回收率為97.1%～102.8%。用液質(zhì)聯(lián)用法對中國被毛孢、蛹擬青霉、古尼擬青霉、蟬棒束孢、細(xì)腳棒束孢、戴氏綠僵菌和粉被瑪利亞霉菌絲樣品中16種游離氨基酸含量的測定結(jié)果顯示，同一菌株中各種氨基酸的含量相差較大，但所有供菌株中含量最高的均為苯丙氨酸，它在不同供試菌株中的含量范圍為0.718～2.173 mg/g，其中中國被毛孢的苯丙氨酸含量最高;供試菌株中含量較高的氨基酸還有脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和谷氨酸，它們含量大部分都在0.3 mg/g以上，較其他氨基酸含量明顯較高，可作為判定蟲生真菌中游離氨基酸的特征指標(biāo)。不同菌株間游離氨基酸總量也存在較大差異，中國被毛孢中游離氨基酸總含量為7.537 mg/g，較蟬擬青霉 (3.196 mg/g)的總含量高出1.36倍?？傊?，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可以準(zhǔn)確地對蟲生真菌中16種游離氨基酸進(jìn)行快速檢測，其測定結(jié)果可為蟲生真菌中游離氨基酸特征鑒定、資源利用和食用價值評價提供技術(shù)和理論參考。

［1］ 李增智，黃勃，李春如，等.確證冬蟲夏草無性型的分子生物學(xué)證據(jù)［J］.菌物系統(tǒng)，2000，19(1):60-64.

［2］ 梁宗琦.蛹蟲草無性型——蛹草擬青霉的確證［J］.食用菌學(xué)報，2001，8(4):28-32.

［3］ 胡豐林，李增智.蟲草及相關(guān)真菌的次生代謝產(chǎn)物及其活性［J］.菌物學(xué)報，2007，26(4):607-632.

［4］ 梁宗琦.我國蟲草屬真菌研究開發(fā)的現(xiàn)狀及思考［J］.食用菌學(xué)報，2001，8(2):53-62.

［5］ 丁婷，胡豐林，耿德貴，等.冬蟲夏草及其無性型菌株發(fā)酵液中核苷類成分的HPLC法定量分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(6):97-99.

［6］ 何亞瓊，胡豐林，王利，等.蟲草及其無性型中的抗腫瘤細(xì)胞活性成分［J］.生物學(xué)雜志，2008，25(1):1-4.

［7］ 胡豐林，陸瑞利，李增智.一種被毛孢代謝物中自由基清除劑的分析、分離和制備［J］.微生物學(xué)報，2008，48(8):1 035-1 042.

［8］ 丁永勝，牟世芬.氨基酸的分析方法及其應(yīng)用進(jìn)展［J］.色譜，2004，22(3):210-215.

［9］ Sánchez C L，Cubero J，Sánchez J，et al.Screening for human milk amino Acids by HPLC-ESI-MS/MS［J］.Food Analytical Methods，2011，5(2):312-318.

［10］ 黃翼飛，胡靜.液相色譜-電噴霧離子阱串聯(lián)質(zhì)譜同時分析煙草中的20種游離氨基酸［J］.色譜，2010，28(6):615-622.

［11］ 劉陽，倪君君，相婷，等.直接注入式串聯(lián)質(zhì)譜法測定氨基酸含量［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2011，28(3):198-205.