正交試驗(yàn)優(yōu)化鼠曲草色素提取及其穩(wěn)定性

丁 月，徐 超，陳霞霞，鄭易林，萬(wàn)力婷，陳伊夢(mèng)，王鴻飛*

(寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系，浙江 寧波 315211)

鼠曲草(Herba Gnaphaii Affinis)，為菊科鼠曲草屬，又稱清明菜、佛耳草等，主要以野生為主，分布于長(zhǎng)江中下游一帶，如浙江、福建、江蘇等省份，《本草拾遺》記載：鼠曲草性味甘、平，無(wú)毒，具有止咳化痰、降血壓、平喘、解毒等功效[1]。作為一種野生蔬菜，鼠曲草不僅富含人體所必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更含有對(duì)人體有益的功能因子如黃酮、揮發(fā)油、豆甾醇等，有治療特性，花、根、葉可以藥用[2-3]。鼠曲草色素屬于葉綠素，在自然狀態(tài)下主要以葉綠素、葉黃素等形式存在，顏色表現(xiàn)為綠色、淺黃色。本實(shí)驗(yàn)以鼠曲草為原料，采用乙醇浸提法提取鼠曲草色素，分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及浸提時(shí)間等因素對(duì)浸提效果的影響，通過(guò)L9(34)正交表排列優(yōu)化提取工藝參數(shù)，同時(shí)研究了光照、溫度、溶液pH值及食品添加劑對(duì)鼠曲草色素穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠曲草 江蘇沛縣野生蔬菜研究所。

高速藥物粉碎機(jī) 山東青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司；紫外分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電子天平 余姚市金諾天平儀器有限公司；酸度計(jì) 美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 鼠曲草色素提取工藝流程

新鮮鼠曲草→烘干→粉碎→過(guò)篩(60目)→稱質(zhì)量→乙醇浸提

將新鮮鼠曲草于105℃烘干2h，粉碎后過(guò)60目篩得到均勻的鼠曲草粉末，稱取相同質(zhì)量的粉末特定條件下進(jìn)行乙醇浸提。

采用分光光度法，以丙酮為提取劑[4]，經(jīng)測(cè)定鼠曲草中葉綠素含量為0.615mg/g。

1.2.2 鼠曲草光譜特性研究

用乙醇溶解色素干粉，以乙醇溶液作為空白對(duì)照，于200～800nm波長(zhǎng)下，在紫外-可見分光光度計(jì)上測(cè)定溶液的吸光度，繪制鼠曲草色素的吸收光譜圖，確定λmax。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以吸光度為考察指標(biāo)，分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及浸提時(shí)間等單因素對(duì)浸提效果的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平，按L9(34)正交表排列優(yōu)化乙醇浸提工藝參數(shù)，因素水平設(shè)計(jì)表見表1，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

表 1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 鼠曲草原液的制備

將采集的新鮮鼠曲草于105℃烘干2h，粉碎后過(guò)60目篩得到均勻的鼠曲草粉末，稱取相同質(zhì)量的粉末特定條件下進(jìn)行乙醇浸提。根據(jù)鼠曲草最優(yōu)提取方案，在90%乙醇溶液、浸提時(shí)間100min、料液比1：300條件下浸提后，用抽濾裝置抽濾浸提液，所得液體即為色素原液。

1.2.5 光照對(duì)鼠曲草氧化穩(wěn)定性的影響

分別取等量鼠曲草色素提取液置于15支試管中，每5支為一組，調(diào)節(jié)溶液pH值至7，然后分別置于避光，自然光照射處和紫外光照射處，在1、2、3、4h時(shí)測(cè)其在波長(zhǎng)416nm處的吸光度。

1.2.6 溫度對(duì)鼠曲草氧化穩(wěn)定性的影響

分別取等量鼠曲草色素提取液3 份，分別放入30～90℃的水浴鍋中保持1h，取出冷卻并調(diào)節(jié)溶液pH值至7，測(cè)其在波長(zhǎng)416nm處的吸光度[5]。

1.2.7 溶液pH值對(duì)鼠曲草氧化穩(wěn)定性的影響

取等量鼠曲草色素提取液6份，分別用已配制好的0.1mol/L NaOH溶液和0.1mol/L HCl溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液pH值分別調(diào)至5～10，放置1h后，測(cè)其在416nm波長(zhǎng)處的吸光度[6]。

1.2.8 食品添加劑對(duì)鼠曲草氧化穩(wěn)定性的影響

取等量稀釋鼠曲草色素提取液多份，分別加入0.1mol/L NaCl，蔗糖溶液，F(xiàn)e3+、Cu2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+溶液，于室溫避光條件下放置1h后，測(cè)其在416nm波長(zhǎng)處的吸光度[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠曲草色素最大吸收峰波長(zhǎng)的確定

在200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)鼠曲草色素提取液進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖 1 鼠曲草色素此外光光譜圖Fig.1 UV-spectrum of pigment from Herba Gnaphaii Affinis

由圖1可知，鼠曲草色素在400～700nm間有兩個(gè)吸收峰，其中416nm處呈現(xiàn)明顯的最大吸收峰，因此，選定416nm作為測(cè)定鼠曲草色素的最大吸收波長(zhǎng)。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)鼠曲草色素提取效果的影響

圖 2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)浸提效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency

由圖2可知，在料液比1：100，室溫25℃浸提60min條件下，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，吸光度先上升后下降，在體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)到達(dá)最大值，表明80%乙醇體積分?jǐn)?shù)是提取鼠曲草色素的適宜體積分?jǐn)?shù)。

2.3 浸提時(shí)間對(duì)鼠曲草色素提取效果的影響

圖 3 浸提時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

由圖3可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1：100，室溫25℃條件下，隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，鼠曲草色素提取液的吸光度逐漸升高，在浸提時(shí)間為80min時(shí)，吸光度達(dá)到最大值；再延長(zhǎng)浸提時(shí)間至140min，提取液的吸光度變化不明顯，為了節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間并達(dá)到最理想的提取效果，確定80min為較優(yōu)化的提取時(shí)間。

2.4 料液比對(duì)鼠曲草色素提取效果的影響

圖 4 料液比對(duì)浸提效果的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on extraction efficiency

由圖4可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1：100、室溫25℃、浸提80min條件下，隨著浸提液用量的增加，鼠曲草色素提取液的吸光度先升高后降低，在料液比為1：200是呈現(xiàn)最大值，表明料液比為1：200時(shí)，鼠曲草色素提取效果最佳。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表 2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析Table 2 Trials and results of orthogonal experiment

采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提時(shí)間在3個(gè)不同水平上進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表2。根據(jù)表2的計(jì)算結(jié)果可知，鼠曲草色素提取液的乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提時(shí)間的極差分別為0.279、0.015、0.085，各因素對(duì)鼠曲草中色素浸提的影響的主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞浸提時(shí)間＞料液比。鼠曲草色素提取的最適工藝為A3B3C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、浸提時(shí)間100min、料液比1：300(g/mL)，在此工藝下提取的溶液吸光度最大。

2.6 鼠曲草色素穩(wěn)定性研究

2.6.1 鼠曲草色素光穩(wěn)定性

圖 5 光照對(duì)鼠曲草色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of light exposure on the stability of pigment from Herba Gnaphaii Affinis

由圖5可知，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度逐漸降低。當(dāng)光照時(shí)間小于4h時(shí)，吸光度基本穩(wěn)定，表明色素不易受光照影響；當(dāng)光照時(shí)間超過(guò)5h時(shí)，吸光度降低明顯，表明色素穩(wěn)定性易受光照影響，光照時(shí)間越長(zhǎng)，色素被破壞的可能性越大[8-9]。因此，色素應(yīng)該在避免光照條件下保存。

2.6.2 鼠曲草色素?zé)岱€(wěn)定性

圖 6 溫度對(duì)鼠曲草色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the stability of pigment from Herba Gnaphaii Affinis

由圖6可知，當(dāng)溫度低于70℃時(shí)，隨著溫度的增加，吸光度基本穩(wěn)定，表明鼠曲草色素?zé)岱€(wěn)定性較好；當(dāng)溫度為70℃時(shí)，吸光度達(dá)到最低；當(dāng)溫度高于70℃時(shí)，吸光度隨著溫度的升高而增大，一方面可能是由于溶液中存在輔色因子，隨著溫度的升高，輔色物質(zhì)逐漸釋放[10]；另一方面可能是由于溫度升高，溫度大于80℃時(shí)，導(dǎo)致乙醇(沸點(diǎn)78℃)揮發(fā)增加，從而引起溶液濃縮，吸光度變大。因此，鼠曲草色素應(yīng)該在較低溫度下保存。

2.6.3 鼠曲草的酸堿穩(wěn)定性

由圖7可知，溶液吸光度隨著溶液pH值的增大而逐漸增大。當(dāng)溶液pH值小于7時(shí)，吸光度降低，色素穩(wěn)定性較差，當(dāng)溶液為pH值大于7時(shí)，色素穩(wěn)定性相對(duì)較好。因此，鼠曲草色素在堿性或者中性溶液中穩(wěn)定性較好，應(yīng)該避免在酸性溶液中保存[11]。

圖 7 pH值對(duì)鼠曲草穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH on the stability of pigment from Herba Gnaphaii Affinis

2.6.4 金屬離子對(duì)鼠曲草色素穩(wěn)定性的影響

表 3 金屬離子對(duì)鼠曲草色素穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of metal ions on the stability of pigment from Herba Gnaphaii Affinis

由表3可知，Cu2+、Ca2+及Zn2+對(duì)色素影響較大，Al3+和Fe3+對(duì)色素影響較少。蔗糖和食鹽對(duì)提取液色素的穩(wěn)定性基本無(wú)影響，金屬離子對(duì)色素溶液有一定影響，一方面可能是由于金屬離子溶液本身有色澤；另一方面可能是由于色素分子與金屬離子形成了螯合物導(dǎo)致溶液吸光度升高或者降低[12-13]。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，得到乙醇浸提鼠曲草最適宜的提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、料液比1：300(g/mL)、浸提時(shí)間100min。通過(guò)鼠曲草色素穩(wěn)定性的研究表明，光照及溫度對(duì)色素穩(wěn)定性較少，不過(guò)色素應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間光照和高溫下保存；溶液pH值對(duì)色素有一定的影響，色素應(yīng)該保存在酸性或者中性溶液中；Cu2+、Ca2+及Zn2+等金屬離子會(huì)影響色素的穩(wěn)定性，在保存過(guò)程中應(yīng)該避免與這些金屬離子接觸。

通過(guò)對(duì)其穩(wěn)定性及著色力的應(yīng)用實(shí)踐，該色素的穩(wěn)定性良好、不易受外界因素影響，是一種良好的常用食品染色劑。晉江民間清明節(jié)常采摘鼠曲草做糕，成為“鼠曲餅”，有的地區(qū)已將該類植物開發(fā)制備成特色佳肴?？傊?，該類植物是具有濃郁民族色彩的食用資源植物[14-16]。再加上其色素穩(wěn)定性好，染色性強(qiáng)，鼠曲草也是集營(yíng)養(yǎng)、保健、藥用功能于一體的野生植物資源[17]，在食品添加劑、天然化妝品等方面均具有良好的開發(fā)前景。對(duì)鼠曲草色素提取工藝和穩(wěn)定性進(jìn)行分析研究，以期能對(duì)未來(lái)可能的開發(fā)起到一定的指導(dǎo)作用。

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