細(xì)菌漆酶的研究及應(yīng)用進(jìn)展

馬瑩瑩 賈紅華 韋萍

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816）

漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）是含銅的多酚氧化酶（polyphenol oxidases，PPO），能通過(guò)O2作為電子傳遞介質(zhì)氧化多種酚類(lèi)化合物，生成苯醌和水。因其與植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物的血漿銅藍(lán)蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上存在著許多相似之處，故同屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族。

漆酶按照來(lái)源分為3大類(lèi)：植物漆酶、真菌漆酶和細(xì)菌漆酶。最早發(fā)現(xiàn)的漆酶就屬于植物漆酶的一種——漆樹(shù)漆酶。盡管漆酶大量存在于植物中，但植物漆酶并未被廣泛應(yīng)用，主要是因?yàn)樘烊恢参锾崛∥锇罅康难趸割?lèi)，植物漆酶很難被檢測(cè)和純化。目前研究和應(yīng)用的最廣泛的是擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina），尤其是白腐真菌所分泌的漆酶。除此之外，還有子囊菌亞門(mén)（Ascomycotina）及半知菌亞門(mén)（Deuteromycotina）。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，漆酶也同樣廣泛存在于細(xì)菌中。由于與真菌漆酶結(jié)構(gòu)不同，細(xì)菌漆酶在Cu2+抗性、糖基化、熱穩(wěn)定性和酶的最適pH范圍廣等方面比真菌漆酶更有優(yōu)勢(shì)［1］。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)方向的快速發(fā)展，對(duì)細(xì)菌漆酶的認(rèn)識(shí)也逐漸深入。由于其與真菌漆酶相比，結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單，有望更容易大規(guī)模生產(chǎn)，從而推動(dòng)其應(yīng)用。

1 細(xì)菌漆酶的生產(chǎn)

1.1 細(xì)菌漆酶的來(lái)源

1993年，Givaudan［2］在生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）中發(fā)現(xiàn)了漆酶活性。該細(xì)菌漆酶是由一個(gè)催化亞基和1或2條長(zhǎng)鏈所組成的多聚體酶類(lèi)，它在細(xì)胞色素形成中扮演著重要的角色，而且能催化利用植物酚類(lèi)物質(zhì)，充當(dāng)電子傳遞者。

Solano等［3］從產(chǎn)黑色素細(xì)菌海單胞菌中分離得到兩種不同的PPO，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其作用底物跟絡(luò)氨酸酶和漆酶的底物特異性一致。Mellano和Cooksey［4］從假單胞菌（Pseudomonas syringae）中分離得到一種漆酶類(lèi)似物——CopA；Brown等［5］從大腸桿菌（Escherichia coli）中發(fā)現(xiàn)了PcoA。這兩種漆酶類(lèi)似物在結(jié)構(gòu)上與多銅氧化酶同源，并表現(xiàn)出Cu2+抗性。

2003年，Endo等［6］將從鏈霉菌中得到的EpoA在物理化學(xué)和生物化學(xué)兩個(gè)方面進(jìn)行了表征，而且構(gòu)建了重組子rEpoA在大腸桿菌中表達(dá)。其同源三聚體相對(duì)分子量為114 kD，底物專(zhuān)一性相對(duì)比較窄，它不能氧化多種漆酶模式底物，如愈創(chuàng)木酚、丁香醛連氮。

隨后，黃俊等［7］報(bào)道Klebsiella細(xì)菌菌株具有漆酶活性。試驗(yàn)驗(yàn)證，該細(xì)菌漆酶經(jīng)60℃處理或pH 10條件下透析20 h仍能保持一定的酶活。

2010年，Tamaki等［8］在溶桿菌屬菌株T-15中發(fā)現(xiàn)了一種能氧化尿酸的酶。該酶由592個(gè)氨基酸組成，含有4個(gè)相同的銅離子結(jié)合位點(diǎn)，而且每個(gè)亞基中含有3個(gè)銅離子。該酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)與海單胞菌的多酚氧化酶有33%的一致性。

目前，研究得最透徹的細(xì)菌漆酶是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）芽孢外衣蛋白CotA。其結(jié)構(gòu)與多銅氧化酶相似，具有抗紫外和H2O2氧化的動(dòng)能。因?yàn)檠挎叩奶厥鈽?gòu)造，CotA具有極好的溫度耐受性，在80℃下的半衰期為2 h，其最適溫度為75℃。2010年，Mao等［9］利用功能篩選的方法，從紅樹(shù)林環(huán)境中篩選出一個(gè)表達(dá)產(chǎn)物具有漆酶活性的新基因Lac591，其基因序列全長(zhǎng)1 500 bp；Lac591有4個(gè)作為銅離子結(jié)合位點(diǎn)的組氨酸保守區(qū)域，且該基因與嗜堿芽孢桿菌（Bacillus halodurans C-125）的漆酶相比同源性為52%。該酶在pH7.0-10.0范圍內(nèi)仍能保留大于80%的酶活（愈創(chuàng)木酚為底物），最適反應(yīng)溫度為55℃。

2011年，F(xiàn)ang等［10］從海洋微生物中獲得一段大小為1.32 kb的細(xì)菌漆酶基因，命名為L(zhǎng)ac15。Lac15有439個(gè)氨基酸，含有3個(gè)保守的Cu2+結(jié)合區(qū)域。Lac15在pH5.5-9.0和溫度15-45℃下能保持穩(wěn)定的活性。與真菌漆酶相比，Lac15具有極好的氯化物耐受性；在氯化物濃度不高于700 mmol/L時(shí)，Lac15的活性提高了2倍，甚至在氯化物濃度為1 000 mmol/L時(shí)也能保持正常的活性。

此外，嗜熱菌中的超嗜熱菌（Aquifex aeolicus）、嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）中也有報(bào)道存在漆酶活性。

1.2 細(xì)菌漆酶的生產(chǎn)

與其他催化劑相比，酶的生產(chǎn)成本往往比較高，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基條件提高酶產(chǎn)量是重要的降低生產(chǎn)成本的可行性方法，主要通過(guò)碳源和氮源的選擇達(dá)到提高細(xì)菌漆酶產(chǎn)量目的。

Jing等［40］對(duì)淡紫灰鏈霉菌通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化能同時(shí)提高漆酶和木質(zhì)素過(guò)氧化酶的產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中C/N的摩爾比是提高漆酶產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，當(dāng)其在1.43-1.48之間時(shí)，漆酶酶活最高能達(dá)到0.107 4 U/mL。

Niladevi等［41］利用稻草對(duì)沙鏈霉菌進(jìn)行固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的研究發(fā)現(xiàn)，與咖啡漿相比，稻草更適合于漆酶的生產(chǎn)。最優(yōu)條件下其漆酶酶活能達(dá)到55.4 U/g。

謝迎春等［42］從抗生素鏈霉菌中提取目的基因phs，利用pET-28a（+）質(zhì)粒作為載體，以E.coli為表達(dá)宿主高效表達(dá)吩惡嗪酮合成酶（PHS）。通過(guò)對(duì)各種可能影響表達(dá)的因素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基pH7.0、Cu2+濃度1.5 mmol/L、誘導(dǎo)溫度30℃、IPTG誘導(dǎo)濃度1 mmol/L、菌體生長(zhǎng)密度OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)16 h產(chǎn)PHS量最高，能達(dá)到7 U/mL。

2 細(xì)菌漆酶的結(jié)構(gòu)

細(xì)菌漆酶屬于糖蛋白，一般以單體蛋白的形式存在。不同來(lái)源的細(xì)菌漆酶其相對(duì)分子量差異很大，其糖基化的程度也不一樣。細(xì)菌漆酶一般由幾種同工酶或亞基組成，如生脂固氮螺菌就是由3個(gè)亞基組成。

Katz等在抗生素鏈霉菌（Streptomyces antibioticus）的細(xì)胞抽提物中發(fā)現(xiàn)一種具有漆酶活性的物質(zhì)，即吩惡嗪酮合成酶（Phenoxazinone synthase，PHS）。PHS 是一種球狀蛋白，每個(gè)蛋白亞基大小為 75 × 60 × 50 ?3。PHS結(jié)構(gòu)一般分為 3個(gè)結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域一含有9個(gè)β股，結(jié)構(gòu)域二含有 11 個(gè)，結(jié)構(gòu)域三包含2個(gè)短的螺旋片段。PHS 的 3D 結(jié)構(gòu)與其他兩種多銅氧化酶（CotA和 CueO）類(lèi)似，只是 PHS 含有612氨基酸，相對(duì)而言，其他兩種則較小，分別為 513和488 個(gè)氨基酸序列。Alex等用分辨率達(dá)2.30 ?的X-射線(xiàn)衍射儀對(duì)PHS晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了成功的解析，并發(fā)現(xiàn)一些特殊的特征［43］。其結(jié)構(gòu)形成了一個(gè)六聚的環(huán)，外徑為185 ?，中心有一個(gè)直徑為50 ?的大空腔。六聚體亞基含有5個(gè)銅離子和3類(lèi)銅結(jié)合域，其中第5個(gè)銅離子為PHS所特有的，它位于結(jié)構(gòu)域2和結(jié)構(gòu)域3的連接區(qū)域。其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

表1 已報(bào)道的細(xì)菌漆酶和漆酶類(lèi)似物

單核的Ⅰ型銅離子位于結(jié)構(gòu)域三，與2個(gè)His的N和1個(gè)Cys的S配位結(jié)合，其中共價(jià)鍵 Cu-Scys使酶呈現(xiàn)藍(lán)色。Ⅱ型Cu和Ⅲ型Cu形成的三核中心位于結(jié)構(gòu)域一和結(jié)構(gòu)域三的界面上，該三核中心與高度保守的4個(gè) His-X-His花樣的8個(gè)His配位結(jié)合。Ⅲ型Cu結(jié)合6個(gè)，并且原子對(duì)之間還有氧橋，具有強(qiáng)反磁性，導(dǎo)致其對(duì)電子順磁共振效應(yīng)（EPR）的消失。Ⅱ型結(jié)合2個(gè)。第3個(gè)結(jié)構(gòu)域除了有 β-sandwich，還有4個(gè)端得螺旋區(qū)，最后一個(gè)螺旋位于C-末端，由結(jié)構(gòu)域一的Cys85和結(jié)構(gòu)域二的Cys48形成的二硫鍵來(lái)穩(wěn)定。第2對(duì)二硫鍵（Cys117-Cys204）存在于結(jié)構(gòu)域一和結(jié)構(gòu)域二之間。

3 固定化酶

由于天然漆酶在工業(yè)應(yīng)用中容易失活，所以導(dǎo)致成本高，大大限制了其應(yīng)用。因此，提高漆酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用次數(shù)顯得極為重要。

圖 1 PHS銅離子結(jié)構(gòu)圖

漆酶固定化技術(shù)作為一種常用的酶改造方法，近年有一些報(bào)道。Niladevi等［44］利用海藻酸銅成功固定了S. psammoticus 所產(chǎn)多銅氧化酶，通過(guò)8批次連續(xù)脫除苯酚反應(yīng)，固定化多銅氧化酶保持了較好的穩(wěn)定性。Singh等［45］將γ-proteobacterium JB所產(chǎn)漆酶固定到硝化纖維薄膜上，在4-30℃條件下能穩(wěn)定保持100%酶活3個(gè)月。研究證明，固定化方法能有效提高漆酶的穩(wěn)定性和利用效率，其反應(yīng)產(chǎn)物也更易于純化。

磁性高分子微球是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型高分子材料，是指內(nèi)部含有磁性金屬或者金屬化氧化物，具有磁響應(yīng)性的超細(xì)粉末。王穎等發(fā)明了一種用磁性復(fù)合微球固定化漆酶的方法，該方法是以金屬螯合的磁性復(fù)合微球?yàn)檩d體，通過(guò)配位鍵結(jié)合作用將漆酶固定在載體上。載體制備是先利用化學(xué)沉淀法合成磁性四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子，以該納米粒子為核，利用溶膠-凝膠法制得核殼式磁性二氧化硅（SiO2），再以γ-氯丙基三甲氧基硅烷為媒介，在磁性二氧化硅表面接枝一種含羰基或氨基的聚合物，然后通過(guò)螯合一種過(guò)渡金屬離子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+或Co2+）利用金屬螯合配體與蛋白質(zhì)表面供電子氨基酸間的相互作用，將漆酶固定在該載體上。該方法制備的固定化漆酶跟一般方法比較起來(lái)具有快速磁響應(yīng)性能。

4 細(xì)菌漆酶的應(yīng)用

4.1 染料廢水

近來(lái)染料與印染工業(yè)的迅猛發(fā)展，隨之而來(lái)的染料的種類(lèi)和數(shù)量也迅速增加。據(jù)美國(guó)《染料引索》報(bào)道稱(chēng)，目前商品染料種類(lèi)已達(dá)幾萬(wàn)種，年生產(chǎn)量超過(guò)7×105t。人工合成的染料通常含有復(fù)雜的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)、品種繁多、化學(xué)穩(wěn)定性高、生物可降解性低，且多數(shù)染料及其代謝中間產(chǎn)物具有致突變性、致癌性和其他毒性，這也是染料成為重要的環(huán)境污染物的原因之一。

漆酶催化空氣中的氧氣直接氧化分解各種酚類(lèi)染料、取代酚、氯酚、硫酚、雙酚A及芳香胺等，在漆酶介導(dǎo)劑（HBT、ABTS等）存在的情況下，漆酶還可以催化降解與木質(zhì)素相關(guān)的二苯基甲烷、N- 取代對(duì)苯基二胺、有機(jī)磷化合物（農(nóng)藥）、二噁英、偶氮類(lèi)和靛青類(lèi)染料。用漆酶厭氧處理廢水，可除去廢水中的木質(zhì)素衍生物、單寧、酚醛化合物等有毒物質(zhì)。

葉茂等［46］研究發(fā)現(xiàn)，重組漆酶Lac591在金屬離子Ca2+和小分子介質(zhì)（ABTS或HBT）存在下，處理染料14 h降解率能達(dá)到11%（堿性藍(lán)3）、25%（亞甲基藍(lán)）、57%（溴酚藍(lán)）、60%（結(jié)晶紫）、37%（亮藍(lán)R）和10%（酸性紫7）。對(duì)靛紅染料Lac591處理60 min，其降解率即可達(dá)到100%。此外，該酶處理堿木質(zhì)素14 h后，其降解率也可達(dá)11%。

Held等［47］利用礬土固定Bacillus SF的芽孢外衣漆酶進(jìn)行染料脫色。固定化芽孢漆酶蛋白在60℃的半衰期為66-80 h，特別是在堿性條件下，與真菌漆酶相比，細(xì)菌漆酶的熱穩(wěn)定性極高。在pH9.5的條件下，固定化Bacillus SF芽孢漆酶蛋白的半衰期為67 h，利用固定化細(xì)菌漆酶對(duì)紡織染料進(jìn)行脫色，60℃處理90 min 后，脫色率達(dá)99%。

4.2 電化學(xué)領(lǐng)域

漆酶在催化底物的同時(shí)，氧分子一步4個(gè)電子被還原生成水，在生物電子設(shè)備的研制中成為理想的生物電極陰極催化劑。如檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)的生物傳感器、體內(nèi)醫(yī)療設(shè)備供電的植入式生物燃料電池、疾病診斷等。漆酶電化學(xué)研究具有十分重要的意義，除能快速靈敏地檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)，在研究氧化還原蛋白質(zhì)的荷電界面空間取向的同時(shí)，還能有助于人們了解蛋白質(zhì)大分子的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的關(guān)系，以及蛋白質(zhì)在生命體內(nèi)的代謝機(jī)制和生理作用。

Beneyton等［48］首次將cotA固定到玻璃碳電極上，制備成生物燃料電池。其電流的大小是直接跟cotA的催化效率（kcat/Km）相關(guān)的。經(jīng)cotA修飾后的電極最適反應(yīng)溫度是45-50℃，而且能保持穩(wěn)定的催化活性至少7周。

4.3 造紙

造紙工業(yè)中，傳統(tǒng)的化學(xué)制漿最大的缺陷是木質(zhì)素去除不徹底，而且殘留的木質(zhì)素會(huì)使紙張變成褐色，所以之后還要進(jìn)行漂白；而傳統(tǒng)的氯法漂白產(chǎn)生的廢水不但污染環(huán)境，而且漂白后的紙張極易反彈。

利用漆酶進(jìn)行生物漂白不僅能避免環(huán)境問(wèn)題，還能提高紙張的質(zhì)量和強(qiáng)度。但是漆酶的氧化還原電位比較低，不能降解木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中90%的非酚型結(jié)構(gòu)單元。因此，還需要加入一些小分子化合物作為介導(dǎo)劑起到傳遞電子的作用。研究指出，一些帶有N-OH基團(tuán)的N-雜環(huán)物，如1-羥基苯并三唑（HBT）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、紫尿酸（VIO）和N-羥基乙酰苯胺（NHA）等均為良好的小分子介質(zhì)。

首次細(xì)菌漆酶應(yīng)用于造紙工業(yè)中是2003年Arias等［49］利用S.cyaneus CECT3335所產(chǎn)漆酶，以ABTS為小分子介質(zhì)，降解桉樹(shù)中的木質(zhì)素，與真菌漆酶相比，其降解效率提高了18.4%。最近，γ- proteobacterium JB所產(chǎn)漆酶也成功應(yīng)用于紙漿的生物降解中［50］。在最優(yōu)條件下，同樣是以ABTS為小分子介質(zhì)，紙漿的澄清度能提高5.89%，卡伯值降低21.1%。

5 小結(jié)

現(xiàn)階段，由于細(xì)菌漆酶在各方面的應(yīng)用使得人們對(duì)它的關(guān)注度越來(lái)越高，但對(duì)其研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，尤其國(guó)內(nèi)關(guān)于細(xì)菌漆酶的報(bào)道很少。細(xì)菌漆酶的分子結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理、如何通過(guò)物理和化學(xué)等手段進(jìn)一步提高細(xì)菌漆酶的利用率還有待深入研究。今后可以考慮在以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究：第一，細(xì)菌漆酶的分子結(jié)構(gòu)，以及不同細(xì)菌漆酶間不同的催化機(jī)制，為高活性細(xì)菌漆酶在蛋白質(zhì)水平上改造提供依據(jù)；第二，篩選更高產(chǎn)漆酶的野生菌株，優(yōu)化細(xì)菌漆酶的生產(chǎn)，為其工業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)；第三，嘗試更多的固定化載體固定細(xì)菌漆酶，減少酶活損失的同時(shí)能最大限度保持酶的活性。

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