蛋白片段互補(bǔ)分析方法及其應(yīng)用

張潔 柳長柏

（三峽大學(xué)分子生物學(xué)研究所，宜昌 443002）

蛋白質(zhì)是生命體的重要組成成分，是細(xì)胞活性及功能的最終執(zhí)行者。蛋白質(zhì)之間復(fù)雜的相互作用決定著生物體的復(fù)雜程度。不同細(xì)胞在不同生理或病理狀態(tài)下所表達(dá)的蛋白質(zhì)及其功能也不盡相同，因此對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)定位及蛋白質(zhì)之間相互作用的研究將為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)提供直接的依據(jù)，也可為疾病治療提供潛在靶點(diǎn)。

迄今，研究蛋白質(zhì)相互作用的方法主要有酵母雙雜交技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)及雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)等。新近發(fā)展起來的蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析（protein fragment complementation assay，PCA）技術(shù)因?yàn)榭梢栽隗w內(nèi)外動態(tài)地研究蛋白質(zhì)相互作用而日趨引人注目。PCA是一種高靈敏度，可定量化的，高通量篩選方法，可動態(tài)地觀察活細(xì)胞、器官、甚至個(gè)體水平蛋白相互作用，被廣泛地應(yīng)用到藥物遞送，化學(xué)遺傳學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)等研究領(lǐng)域［1，2］。

1 PCA原理

所謂PCA是指將某個(gè)功能蛋白切成兩段（如N端和C端），分別與另外兩種目標(biāo)蛋白相連形成兩個(gè)融合蛋白。在一個(gè)反應(yīng)體系中，兩個(gè)目標(biāo)蛋白的相互作用使得兩個(gè)功能蛋白質(zhì)片段相互靠近，互補(bǔ)并重建功能蛋白質(zhì)的活性，通過檢測功能蛋白質(zhì)的活性來判斷目標(biāo)蛋白質(zhì)間的相互作用。在PCA體系中，功能蛋白的兩個(gè)片段可以互補(bǔ)融合成報(bào)告蛋白（如酶、熒光蛋白等）。只有兩個(gè)目標(biāo)蛋白發(fā)生了相互作用，才能使報(bào)告蛋白的兩個(gè)片段相互靠近，重新折疊恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)，重構(gòu)生物活性。圖1以熒光蛋白為例說明PCA原理。X、Y和Z為研究目標(biāo)蛋白，N、C為由報(bào)告蛋白的熒光蛋白切割形成的N端和C端片段。（1）目標(biāo)蛋白X通過連接子與N片段相連，目標(biāo)蛋白Y通過連接子與C片段相連。如果X和Y不發(fā)生相互作用，則熒光蛋白不能重新折疊、重構(gòu)熒光生物活性；（2）目標(biāo)蛋白X和Z可發(fā)生相互作用，使N片段和C片段重新折疊重構(gòu)熒光蛋白生物活性。

圖1 PCA原理示意圖

2 PCA報(bào)告蛋白的選擇

PCA方法的特征是報(bào)告蛋白的互補(bǔ)片段不能自發(fā)折疊，只有在目標(biāo)蛋白發(fā)生相互作用后，才促使報(bào)告蛋白再折疊恢復(fù)生物活性。自發(fā)折疊將會導(dǎo)致假陽性信號。報(bào)告蛋白互補(bǔ)片段的融合會影響互相作用的蛋白以及檢測其相互作用的能力。因此，第一，對于任何一個(gè)報(bào)告蛋白來說，要確保最佳位點(diǎn)切割不會損害其功能，可通過再折疊形成有功能的融合蛋白；第二，需考慮報(bào)告蛋白的定位或者互補(bǔ)片段的鑒定是否影響PCA試驗(yàn)結(jié)果［3］。

目前PCA所使用的報(bào)告蛋白包括二氫葉酸還原酶［4］（DHFR），β-內(nèi)酰胺酶［5］（β-lactamase），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶Gaussia luciferases［6］、Renilla luciferases［7］及Cre重組酶［8］等。其結(jié)構(gòu)分為兩部分，單獨(dú)表達(dá)時(shí)均無活性，可通過試驗(yàn)檢測到最佳切割位點(diǎn)，通過連接子（soft linker）與目標(biāo)蛋白連接。Remy等［3］在目標(biāo)蛋白和報(bào)告蛋白片段之間使用連接子（Gly.Gly.Gly.Gly.Ser）n發(fā)現(xiàn)，該連接子具有很好的靈活性，能有效地使互補(bǔ)片段折疊復(fù)性而不影響各個(gè)蛋白（片段）的相互作用。

2.1 基于DHFR的PCA

DHFR在真核細(xì)胞核苷酸生物合成中起重要作用，催化二氫葉酸還原成四氫葉酸，細(xì)胞缺失DHFR是致死性的，而成為極佳報(bào)告蛋白應(yīng)用于PCA研究。Remy等［9］研究發(fā)現(xiàn)，DHFR-PCA有兩個(gè)層面的檢測方法：（1）利用DHFR對細(xì)胞生存是必須的特征，通過觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)來間接反映出兩種目標(biāo)蛋白有無相互作用。其缺點(diǎn)是不能反映出目標(biāo)蛋白是何時(shí)發(fā)生作用，作用部位等動態(tài)過程；（2）熒光標(biāo)記的底物甲氨蝶呤只能與完整的DHFR作用才能產(chǎn)生熒光，因而可以動態(tài)地反應(yīng)目標(biāo)蛋白相互作用發(fā)生的時(shí)間、位置等。

2.2 基于β-lactamase的PCA

β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌產(chǎn)生的以β-內(nèi)酰胺類藥物為底物的水解酶。Galarneau等［5］使用TEM-1型 β-lactamase建立了PCA，該亞型缺乏由23個(gè)氨基酸組成的胞質(zhì)分泌信號序列，不能分泌到胞質(zhì)中。TEM-1型 β-lactamase在真核生物中沒有同源體，對細(xì)胞沒有毒性，故而β-lactamase-PCA被普遍用于在真核細(xì)胞和沒有本底表達(dá)的大部分真核生物個(gè)體中的蛋白相互作用研究。

β-lactamase-PCA檢測方法包括：第一，以頭孢菌素類的衍生物頭孢硝噻吩（nitrocefin）為底物，用細(xì)胞裂解液進(jìn)行比色測定，當(dāng)?shù)孜锇l(fā)生水解時(shí)，顏色會由黃色變成紅色。由于nitrocefin不能透過細(xì)胞膜，故只能檢測細(xì)胞裂解液中的蛋白相互作用；第二，用完整的細(xì)胞進(jìn)行熒光分析，以CCF2/AM為熒光底物，當(dāng)CCF2/AM進(jìn)入細(xì)胞膜，在胞內(nèi)酯酶的作用下釋放內(nèi)酰胺酶的底物CCF2。CCF2能夠被雙重激發(fā)，在409 nm波長激發(fā)光下將能量傳遞給受體發(fā)色基團(tuán)，在520 nm波長處發(fā)綠色熒光。而當(dāng)CCF2在β-內(nèi)酰胺酶作用下水解則使2個(gè)發(fā)色基團(tuán)分開。在相同激發(fā)光下，因發(fā)色基團(tuán)離受體較遠(yuǎn)（>10 nm），供受體之間不能發(fā)生熒光能量共振，只能于477 nm波長處發(fā)出供體自身的藍(lán)色熒光。檢測細(xì)胞內(nèi)熒光定量，或運(yùn)用熒光顯微鏡通過觀察細(xì)胞內(nèi)因底物降解而發(fā)生藍(lán)色熒光及其定位來判斷β-內(nèi)酰胺酶的兩個(gè)片段是否因目標(biāo)蛋白相互作用而互補(bǔ)，恢復(fù)了完整的β-內(nèi)酰胺酶活性。

2.3 基于熒光蛋白的PCA

綠色熒光蛋白及其變種由于不需要任何底物或者輔助因子就可以產(chǎn)生熒光，被廣泛用作PCA的報(bào)告蛋白，通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、光譜法等可用GFP-PCA，YFP-PCA觀察蛋白之間的相互作用，活細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合體的形成，還可應(yīng)用到細(xì)胞cDNA文庫的篩選等［10］。但是與具有酶活性的報(bào)告蛋白相比，基于熒光蛋白的PCA不適合進(jìn)行定量化和動態(tài)研究，僅能作為定性研究。

2.4 基于熒光素酶的PCA

分泌型熒光素酶（Gaussia luciferase，Gluc）和花蟲型熒光素酶（Renilla luciferases，Rluc）均是從海洋發(fā)光生物體中分離出來的熒光素酶。Gluc是由185個(gè)、Rluc是由312個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)分子，在有氧環(huán)境中，作用于底物腔腸素，在480 nm波長激發(fā)光下發(fā)藍(lán)色熒光。Gluc是一種分泌性蛋白酶，可以檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清，或?qū)嶒?yàn)動物體液，對酶活性進(jìn)行定量分析。

Michnick［11］于人源化Gluc第93位氨基酸進(jìn)行剪切形成2個(gè)片段，通過連接子連接目標(biāo)蛋白，分析了TGF-β信號通路中一些分子之間的相互作用，以及藥物處理對相關(guān)信號分子間相互作用的影響。Stefan等［7］成功地運(yùn)用Rluc-PCA技術(shù)研究了蛋白激酶A在G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號通路中的作用及藥物處理對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響的定量分析。Gehl等［12］利用浮葉熒光素酶為報(bào)告蛋白的PCA方法實(shí)時(shí)定量分析了鉬元素輔因子生物合成蛋白CNX6和CNX7，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)定量監(jiān)測蛋白復(fù)合體的組裝。

2.5 基于Cre重組酶的PCA

Cre重組酶存在于大腸桿菌噬菌體P1中，由343個(gè)氨基酸組成DNA重組酶，可識別Loxp位點(diǎn)等特異性序列而引起DNA重組。研究表明，切割后的Cre重組酶片段允許其兩個(gè)啟動子調(diào)控DNA重組。

Hirrlinger等［8］設(shè) 計(jì) 了Cre-ERT2-PCA方 法，ERT2是人雌二醇受體，Cre-ERT2是將Cre融合到ERT2配體結(jié)構(gòu)域。Cre-ERT2對他莫昔芬及其代謝產(chǎn)物4-羥泰米芬（4-OHT）有高度敏感性，在缺乏誘導(dǎo)劑他莫昔芬時(shí)，融合蛋白將被熱激蛋白綁定，在細(xì)胞漿中無法進(jìn)入胞核。而加入他莫昔芬時(shí)，Cre-ERT2將從復(fù)合體中釋放出來，進(jìn)入細(xì)胞核切除LoxP位點(diǎn)之間的序列。研究結(jié)果表明，該方法適用于包含Loxp等位基因的模型小鼠誘導(dǎo)DNA重組。

3 PCA的應(yīng)用

3.1 篩選相互作用的蛋白質(zhì)文庫

Galarneau等［10］證實(shí)β-lactamase-PCA提供了一種篩選蛋白相互作用的模型，該模型對于信號和本底表達(dá)的比例可達(dá)到10∶1到250∶1，較其他的PCA效果靈敏。該方法具有一定的廣泛性，作者檢測了一些已知的蛋白相互作用，包括同型二聚體的亮氨酸拉鏈模型，Bad和Bcl2，PKB以及底物Bad。研究表明，β-lactamase PCA允許檢測蛋白之間相互作用，因?yàn)闆]有近似的本底表達(dá)導(dǎo)致酶的自發(fā)折疊。

具有簡單性、靈敏性和穩(wěn)固性的體外β-lactamase PCA提供了一種大規(guī)模分析蛋白相互作用的有用的方法。而熒光共振能量轉(zhuǎn)移策略可以提供相同的信息，但是在大規(guī)模應(yīng)用中需要小心地檢測熒光染料標(biāo)記的蛋白表達(dá)水平；β-半乳糖苷酶亞基互補(bǔ)策略分析有自發(fā)亞基組合導(dǎo)致有本底表達(dá)的干擾。

3.2 cDNA文庫篩選

PCA方法是一種高通量的蛋白質(zhì)文庫篩選方法，該方法依賴于細(xì)胞依賴性蛋白的特殊功能的篩選。首先是獵物蛋白和誘餌蛋白自然發(fā)生的相互作用，通過在活細(xì)胞內(nèi)監(jiān)測PCA報(bào)告蛋白的再折疊。篩選的重要的特點(diǎn)是相互作用可以直接被檢測到，同時(shí)PCA片段不會干擾蛋白的靶向作用和修飾作用。繼而通過PCA檢測到的蛋白相互作用能被代理劑擾亂，如激素類或特殊的抑制劑［10］。

GFP-PCA可以檢測蛋白相互作用的亞細(xì)胞定位，信號通路中的代理劑的影響。因此，依賴于PCA的篩選策略都會和一些直接的功能分析相結(jié)合。研究者應(yīng)用這一策略來鑒定絲/蘇氨酸蛋白激酶PKB/Akt的新型的底物和調(diào)節(jié)物。該方法提供了鑒定和確證任何細(xì)胞過程中蛋白的作用，識別酶的底物和調(diào)節(jié)蛋白［11］。

3.3 繪制生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)

生物化學(xué)的網(wǎng)絡(luò)圖可以通過研究活細(xì)胞內(nèi)的蛋白和蛋白之間動態(tài)的研究來繪制。通過PCA這種方法可以繪制動態(tài)圖以及鑒定在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中可能出現(xiàn)的新的起某種作用的元件。該方法比傳統(tǒng)的靶向藥物治療提高了準(zhǔn)確度。

Michnick等［13］利用DHFR-PCA繪制了酪氨酸激酶受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)現(xiàn)，RTK信號通路網(wǎng)絡(luò)與現(xiàn)有模型一致，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)一些新型的相互作用（35個(gè)全長蛋白中有14個(gè)有效，其中有5個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的）。結(jié)果表明PCA策略可以完成一般基因功能的確認(rèn)及通路圖的繪制，同時(shí)可以監(jiān)測信號通路中蛋白質(zhì)的一些潛在的反應(yīng)。該方法的一個(gè)大規(guī)模的應(yīng)用是連接一個(gè)特殊的藥物在特異性的信號通路途徑中，監(jiān)測藥物的作用。Remy等［14］設(shè)計(jì)的GFP-PCA的方法可以探測完整的活細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用，不僅可以動態(tài)研究蛋白的相互作用，而且可以研究在物理或者化學(xué)因子作用下的微干擾，并設(shè)計(jì)了Gluc-PCA監(jiān)測TGF-β信號通路中Smad和PKB的表達(dá)情況。Michnick［15］使用YFP-PCA方法研究MAP激酶介導(dǎo)的信號通路，繪制該通路中影響因子，繼而篩選一些藥物和治療靶點(diǎn)。Manderson等［16］用依賴于熒光素酶的PCA發(fā)現(xiàn)一種新的絲/蘇氨酸激酶ElmI在酵母轉(zhuǎn)錄因子SBF的失活中起很重要的作用。Stefan［7］使用Rluc-PCA定量研究了G蛋白偶聯(lián)受體通路中的一些藥物處理后的影響，繪制相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用于藥物篩選。

3.4 配受體相互作用及潛在治療

配受體相互作用促進(jìn)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，治療因素靶向細(xì)胞表面受體繼而與配體結(jié)合。著重強(qiáng)調(diào)研究配受體復(fù)合體在完整的細(xì)胞內(nèi)和活體動物中完成對正常的信號通路中疾病，藥物作用等方面的研究。目前主要用的是熒光或放射性配體。發(fā)展成像分析在生理?xiàng)l件下定量檢測配受體復(fù)合體促進(jìn)了對疾病和加快藥物遞送的研究進(jìn)展。

Luker等［17］使用熒光素酶蛋白片段互補(bǔ)分析定量的檢測趨化因子配體12（CXCL12）和趨化因子受體4，7（CXCR4，7）綁定情況。研究表明：小分子抑制劑CXCR4和CXCR7可以特異性的阻滯CXCL12在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合，同時(shí)顯示不同的趨化因子抑制劑在與受體結(jié)合時(shí)動力學(xué)的不同。在小鼠乳腺癌模型生物發(fā)光成像技術(shù)展示了CXCL12-CXCR7結(jié)合發(fā)生在轉(zhuǎn)移性腫瘤中。Gluc-PCA可以定量的分析藥物的靶向作用，允許實(shí)時(shí)定量的分析受體的靶向性，其生成物在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移時(shí)效應(yīng)。且該成像系統(tǒng)可以應(yīng)用于任何配受體結(jié)合的分析。

3.5 發(fā)現(xiàn)新型藥物及高通量篩選藥物

G蛋白偶聯(lián)受體超家族是很重要的一類制藥靶點(diǎn)，用以研發(fā)新型藥物，而激動劑誘導(dǎo)的第二信使以及下游的蛋白激酶A（PKA）是信號通路中的關(guān)鍵影響因子。

Stefan等［6］設(shè)計(jì)了Rluc-PCA研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)信號通路中的特異性藥物。該方法可以實(shí)時(shí)定量的研究某一特異的激動劑及拮抗劑對于細(xì)胞或小鼠的影響。L?fdahl等［18］用β-lactamase篩 選 與TNF-α結(jié)合的親合體分子，用于高通量篩選藥物治療腫瘤。Hashimoto等［19］以單體的香菇珊瑚來源的綠色熒光蛋白（mKG）為報(bào)告基因，在試管內(nèi)使用PCA方法高通量篩選蛋白相互作用抑制劑，完成了高通量篩選藥物。研究表明，在TCF7/β-catenin，PAC1/PAC2，PAC3同源二聚體之間的相互作用的抑制劑中，氨硫脲（TB1）只是PAC3同源二聚體的抑制劑。

4 小結(jié)

PCA技術(shù)是近幾年研究蛋白相互作用的重要策略之一，具有高靈敏性，可逆性，高通量篩選等一系列的優(yōu)勢，同時(shí)報(bào)告蛋白提供了明確可行的檢測手段，包括熒光顯微鏡，酶和底物顯色反應(yīng)。PCA可實(shí)時(shí)定量動態(tài)的反映出蛋白復(fù)合體的組裝與解離過程，應(yīng)用于體內(nèi)外的試驗(yàn)，且克服了雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)中熒光片段的自發(fā)互補(bǔ)及其不可逆性。而熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)及生物發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移對供體的發(fā)射光譜和受體激發(fā)光譜有一定的要求，因此需要更精密的儀器，且操作復(fù)雜［20，21］。

PCA技術(shù)在高通量藥物篩選方面的應(yīng)用是目前關(guān)注的焦點(diǎn)，提高了藥物治療的靶向性，為研發(fā)新藥奠定了基礎(chǔ)。但是PCA互補(bǔ)片段如何重新組合并部分恢復(fù)其功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)還不是很清楚，這其中涉及到蛋白的折疊和兩個(gè)肽段之間精細(xì)的相互作用。如果在以后的研究中克服因信號放大產(chǎn)生的假陽性結(jié)果，以及外源蛋白過量表達(dá)對細(xì)胞產(chǎn)生毒害，PCA將會在生命科學(xué)及醫(yī)藥研究領(lǐng)域中得到更廣泛的應(yīng)用。

［1］ Remy I, Michnick SW. Clonal selection and in vivo quantitation of protein interactions with protein-fragment complementation assays［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96（10）：5394-5399.

［2］ Villalobos V, Naik S, Piwnica-Worms D. Current state of imaging protein-protein interactions in vivo with genetically encoded reporters［J］. Annu Rev Biomed Eng, 2007, 9：321-349.

［3］ Remy I, Michnick SW. Application of protein-fragment complementation assays in cell biology［J］. Tech Insight, 2007, 42（2）：137-145.

［4］ Shibasaki S, SakataK, Ishii J, et al. Development of a yeast protein fragment complementation assay（PCA）system using dihydrofolate reductase（DHFR）with specific additives［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 80（4）：735-743.

［5］ Galarneau A, Primeau M, Trudeau LE, et al. β-lactamase protein fragment complementation assays as in vivo and in vitro sensors of protein-protein interactions［J］. Nat Biotechnol, 2002, 20（6）：619-622.

［6］ Kim SB, Sato M, Tao H. Split Gaussia luciferase-based bioluminescence template for tracing protein dynamics in living cell［J］. Anal Chem, 2009, 81（1）：67-74.

［7］ Stefan E, Aquin S, Berger N, et al. Quantification of dynamic protein complexes using Renilla luciferase fragment complementation applied to protein kinase A activities in vivo［J］. Pans, 2007, 104（43）：16916-16921.

［8］ Hirrlinger J, Requardt RP, Winkler U, et al. Split-CreERT2：temporal control of DNA recombination mediated by split-Cre protein fragment complementation［J］. PLoS One, 2009, 4（12）：e8354.

［9］ Remy I, Campbell-Valois FX, Michnick SW. Detection of proteinprotein interactions using a simple survival protein-fragment complementation assay based on the enzyme dihydrofolate reductase［J］. Nat Protoc, 2007, 2（9）：2120-2125.

［10］ Remy I, Michnick SW. A cDNA library functional screening strategy based on fluorescent protein complementation assays to identify novel components of signaling pathways［J］. Methods, 2004（32）：381-388.

［11］ Remy I, Michnick SW. A highly sensitive protein-protein interaction assay based on Gaussia luciferase［J］. Nature Methoed, 2006, 3（12）：977-979.

［12］ Gehl C, Kaufholdt D, Hamisch D, et al. Quantitative analysis of dynamic protein-protein interactions in planta by a floated-leaf luciferase complementation imaging（FLuCI）assay using binary Gateway vectors［J］. The Plant Journal, 2011, 67：542-553.

［13］ Remy I, Michnick SW. Visualization of biochemical networks in living cells［J］. PNAS, 2001, 98（14）：7678-7683.

［14］ Michnick SW. Protein fragment complementation strategies for biochemical network mapping［J］. Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14：610-617.

［15］ Michnick SW, MacDonald ML, Westwick JK. Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays（PCA）［J］. Methods, 2006, 40：287-293.

［16］ Manderson EN, Malleshaiah M, Michnick SW. A novel genetic screen implicates Elm1 in the inactivation of the yeast transcription factor SBF［J］. PLoS ONE, 2008, 3（1）：e1500.

［17］ Luker KE, Mihalko LA, Schmidt BT, et al. In vivo imaging of ligand receptor binding with Gaussia luciferase complementation［J］. Nat Med, 2012, 18（1）：172-179.

［18］ L?fdahl PA, Nord O, Janzon L, et al. Selection of TNF-α binding affibody molecules using a β-lactamase protein fragment complementation assay［J］. N Biotechnol, 2009, 26（5）：251-259.

［19］ Hashimoto J, Watanabe T, Seki T, et al. Novel in vitro protein fragment complementation assay applicable to high-throughput screening in a 1536-well format［J］. J Biomolecul Screen, 2009, 14（8）：970-979.

［20］ Michnick SW, Ear HP, Landry C, et al. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells［J］. Methods Enzymol, 2010, 470：335-368.

［21］ Kawakami S, Higuchi Y, Hashida M. Nonviral approaches for targeted delivery of plasmid DNA and oligonucleotide［J］. J Pharm Sci, 2008, 97（2）：726-745.