支原體脂蛋白及其變異與宿主互作研究進展

倪博 白方方 劉茂軍 馮志新 熊祺琰 魏建忠 邵國青

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室 國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014；2.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036）

支原體是簡單的可自我復制的最小生物體，基因組簡單，缺乏某些代謝途徑。支原體的種類較多，有80多個種屬［1］，很多都可以感染人和動物，造成慢性感染性疾病，一般不致死。除少數(shù)支原體可胞內(nèi)寄生外，絕大部分支原體以胞外寄生方式生活，一般主要寄生于宿主的呼吸道及泌尿生殖道。支原體沒有細胞壁，僅有一層細胞膜將胞質(zhì)和外界相隔離，胞膜中含有豐富的脂蛋白，稱為脂質(zhì)相關膜蛋白（lipid associated membrane proteins，LAMPs），具有疏水性，可特異性的溶于Triton X-114［4］。大部分支原體脂蛋白都暴露在外，一些脂蛋白的功能與革蘭氏陰性菌的胞漿蛋白相同，具有毒力作用或者是抗體的作用靶位［5，6］。脂蛋白是一類含有脂質(zhì)的膜蛋白，N端含有二酰/三酰甘油半胱氨酸結構，由此錨定于宿主細胞膜上，具有抗原性，并能以高頻率發(fā)生相位、抗原變異，形成多樣化的支原體表面。

許多編碼脂蛋白的基因包含在ABC轉運蛋白的操縱子內(nèi)，ABC轉運蛋白涉及營養(yǎng)攝取、細胞黏附及ATP的分解。如人型支原體（Mycoplasma hominis）的特征性ABC轉運蛋白家族脂蛋白OppA［7］是一種短肽聚合蛋白，有黏附性，具有強ATP酶活性，并且可以誘導細胞凋亡［8］。雞毒支原體（M.gallisepticum）的MslA是一種具有免疫原性的脂蛋白，有毒力作用，在強弱毒株中的表達不同［5］。

隨著分子生物學的發(fā)展，人們利用基因組學和蛋白質(zhì)組學技術對支原體有了更深的了解［2，3］，但是支原體的毒力和致病機制還尚未闡明。近幾年，越來越多的研究指出支原體的脂蛋白在其致病機制中發(fā)揮了重要作用。

1 支原體脂蛋白在免疫反應中發(fā)揮重要作用

支原體膜中豐富的脂蛋白，在天然免疫和感染初期有重要作用［9］。Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）1、2和6是脂蛋白的受體，在免疫反應中介導各種重要通路的活化［10］。脂蛋白可以通過多種機制與宿主發(fā)生作用并引發(fā)宿主細胞損傷，如脂蛋白可以刺激細胞產(chǎn)生前炎性因子、細胞因子、NO等；下調(diào)炎癥反應，使宿主沒有表現(xiàn)出明顯的臨床特征；逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，使其能在宿主細胞中長期生存；具有細胞毒性，可以使宿主細胞發(fā)生壞死或凋亡；在艾滋病的發(fā)病過程中起輔助或促進的作用等。

1.1 支原體脂蛋白致炎性反應

由于缺乏N-?；D移酶，大部分支原體脂蛋白是雙?；?，支原體脂蛋白的這種特殊結構可以強烈刺激巨噬細胞［10］。近期發(fā)現(xiàn)，生殖支原體（M. genitalium）中也存在三?；鞍譓G149，同樣可以通過TLR1和TLR2介導激活NF-κB引起炎癥反應［11］。在低-GC含量革蘭氏陽性菌和支原體中還發(fā)現(xiàn)一種新型結構的脂蛋白，共兩種形式，一種含有N-酰基-S-單?；?丙三基-半胱氨酸，被命名為lyso結構，通過TLR2/6受體可以誘導前炎癥因子的產(chǎn)生；另一種脂蛋白含有特殊酰基，稱為N-乙?；鞍祝瑯涌梢哉T導前炎癥因子產(chǎn)生［12］。

豬肺炎支原體作用于小鼠巨噬細胞MH-S和RAW264.7，可以引發(fā)MAPK（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號轉導通路的三級激酶級聯(lián)反應，其中MAPK的3個信號轉導通路均被激活，包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK（extracellular signalregulated kinases，ERK）通路、p38通路及JNK/SAPK（Jun N-terminal kinases/stress-activated protein，JNK/SAPK）通路，產(chǎn)生一系列活化傳遞信號［13］。此外，還激活NF-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路，誘導細胞大量產(chǎn)生NO、細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）及TNF-α、IL-1β和IL-6［14］。這些炎性產(chǎn)物可以間接促進細胞發(fā)生凋亡。

1.2 支原體脂蛋白誘導細胞凋亡

支原體脂蛋白誘發(fā)細胞凋亡首次發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵支原體（M. fermentans）。發(fā)酵支原體的脂蛋白通過TLR2可以介導淋巴細胞、單核巨噬細胞發(fā)生凋亡，其中caspase-3和caspase-8起重要的調(diào)節(jié)作用［15］。隨后發(fā)現(xiàn)TLR6受體同樣可以介導細胞凋亡，并可以激活核因子NF-κB，其中涉及髓樣分化因子MyD88（myeloid differentiation factor88）與Fas相關死亡域蛋白FADD（Fas-associated with death domain protein）［16］。這其中促分裂素原活化蛋白激酶p38 MAPK及上游的細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶ASK1（apoptosis signal-regulating kinase 1）激活下游通路的核因子NF-κB和轉錄因子激活蛋白AP-1（activating protein-1）［17］。

此外，生殖支原體的脂蛋白LPS可以刺激人單核細胞THP-1產(chǎn)生炎性細胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6，并激活NF-κB誘導細胞發(fā)生凋亡［18］。穿透支原體LAMPs可以通過激活NF-κB誘導小鼠巨噬細胞發(fā)生凋亡［19］。支原體脂蛋白的這種致凋亡能力很可能是支原體致病性的重要組成部分。

本研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體的LAMPs可以引起豬肺泡上皮細胞SJPL及豬肺泡巨噬細胞3D4-21發(fā)生凋亡，可以觀察到細胞染色體皺縮，并產(chǎn)生凋亡小體，還需進一步檢測凋亡通路相關指標，以此來確定LAMPs致凋亡的機制。

2 支原體脂蛋白的變異

由于支原體采取寄生方式生活，它們需要躲避或是破壞宿主的免疫防御系統(tǒng)來適應宿主。支原體的基因組中存在很多編碼脂蛋白的基因家族及相關的變異調(diào)控機制，通過隨機的發(fā)生相位-抗原變異，形成多樣化的支原體表面，以此來躲避宿主免疫［20］。主要變異機制有ON/OFF分子開關、大小變異、結構重組及基因水平轉移等（表1）。

表 1 調(diào)控支原體表面相位-抗原變異的主要機制

2.1 ON/OFF分子開關

目前已發(fā)現(xiàn)3種影響關鍵基因表達的ON/OFF分子開關。一種是天然變異，在基因易變區(qū)內(nèi)插入或刪除核苷酸，發(fā)生DNA滑鏈。如豬鼻支原體vlp基因，只有當啟動子部分的poly A長度為17 bp時，下游vlp基因才開始翻譯，插入或者刪除任一核苷酸都導致翻譯的停止［21］。第二種方式是重組變異，通過識別特殊位點的重組酶進行DNA重組。如牛支原體（M.bovis）、肺炎支原體和無乳支原體（M.agalactiae）的vsp，vsa和vpma基因都含有一個特異位點重組酶，由這個重組酶代替原先的有效啟動子［22-24］。

此外，還有一種基于啟動子倒置的基因重組，如穿透支原體的mlp基因通過倒置啟動子啟動ON/OFF開關的表達［25］。

2.2 大小變異

無乳支原體5 632株理論上可表達91種不同的Vpma表面結構［24］，標準株PG2僅能表達6種。通過插入或刪除重復序列所引起的vpma大小變異可以改變支原體表面結構。

2.3 結構重組

最近，人們在雞滑液支原體（M.synoviae）和生殖支原體中發(fā)現(xiàn)第3種基因變異機制-結構重組，變異的頻率更高?；褐гwvlhA家族由單個vlhA基因和一些缺少5'末端序列的假基因組成。vlhA功能片段與假基因、假基因的復制產(chǎn)物以及所表達的各種缺失片段之間發(fā)生重組，形成大量變異的抗原［26］。生殖支原體的基因組中包含多個MgPar重復區(qū)域，其中MgPar域與mgpB、mgpC為同源體，mgpB、mgpC編碼具有免疫原性的黏附蛋白，mgpB、mgpC及MgPar之間的重組，可以產(chǎn)生高頻率的抗原變異［27］。

2.4 基因水平轉移

隨著越來越多全基因組序列的獲得，人們發(fā)現(xiàn)，在支原體之間存在大量基因水平轉移（horizontal gene transfer，HGT）［28］?；蛩睫D移是指在不同的生物個體之間，或單個細胞內(nèi)部細胞器之間所進行的遺傳物質(zhì)的交換，是相對于垂直基因轉移（親代到子代）而提出的。首次在雞滑液支原體和雞毒支原體之間發(fā)現(xiàn)，這兩個菌株的親緣關系較遠，但編碼血凝素的基因可以從雞毒支原體基因組平移到雞滑液支原體的基因組中。將兩個支原體的全基因組進行對比，發(fā)現(xiàn)滑液支原體中也有大量基因家族發(fā)生水平基因轉移至雞毒支原體，發(fā)生轉移的包括血凝素基因家族，ABC轉運蛋白操縱子，信號肽酶I，唾液酶基因和甘油3磷酸脫氫酶基因［29］。

在許多支原體基因組中都存在完整的或部分的基因轉座酶接合元件ICEs（integrative conjugal elements，ICEs）［無乳支原體、牛支原體、山羊支原體（M.capricolum）、結膜支原體（M.conjunctivae）、發(fā)酵支原體、肺炎支原體、絲狀支原體（M. mycoides）］，這個接合部位很可能是基因水平轉移的通道［30］。

感染同一宿主的不同支原體之間可能會發(fā)生基因交換，由于轉移的大部分基因都是編碼膜蛋白和脂蛋白的序列，基因水平轉移可能是支原體獲得毒力、致病力的重要途徑［31］。

2.5 支原體抗原調(diào)節(jié)

在運動支原體（M.mobile）的脂蛋白中出現(xiàn)了一種新的表面變異-支原體抗原調(diào)節(jié)（Mycoplasmal antigen modulation）［32］。運動支原體的脂蛋白Mvsps可發(fā)生相位變異和抗原變異。有研究表明，Mvsps和抗體間的結合是特異的，由抗體結合引起的Mvsps減少，證明存在一種新型的支原體表面變異，該研究將之稱為“支原體抗原調(diào)節(jié)”。

3 支原體脂蛋白變異對支原體的影響

3.1 支原體脂蛋白變異對細胞黏附的影響

支原體的致病機理復雜，包括引起疾病的發(fā)生和影響整個宿主健康狀況兩個方面。脂蛋白介導的黏附在其致病機理中發(fā)揮重要作用，其中肺炎支原體的末端結構黏附最為典型［33］。肺炎支原體Vsa蛋白是一個可發(fā)生大小-相位變異的脂蛋白家族，在補體反應中是肺炎支原體的防護盾，并且可以促進肺炎支原體黏附于非生物膜上。有研究指出表達長串重復的Vsa的支原體對小鼠MLE-12細胞的黏附性較弱，而表達短Vsa的黏附性強［34］。

3.2 支原體脂蛋白變異對免疫調(diào)節(jié)的影響

鼠肺炎支原體（M. pilmonis）的表面脂蛋白Vsa的長度對補體相關免疫反應的敏感性有影響。長Vsa中含有40個重復序列，對補體有抵抗力；短Vsa僅有5個，甚至更少的重復序列，對補體十分敏感。同時，Vsa的大小還可以調(diào)節(jié)鼠肺炎支原體表面糖蛋白EPS-I的親和力，表達短Vsa脂蛋白的支原體表面上EPS-I的數(shù)量較多，對補體反應敏感。但是本身缺乏EPS-I，同時表達長Vsa脂蛋白的突變體對補體反應也很敏感。因此，EPS-I和Vsa均可調(diào)節(jié)支原體對補體反應的敏感性［35］。

3.3 支原體脂蛋白變異對細胞生理功能影響

豬鼻支原體是細胞系中常見的污染病原，可以影響細胞正常的新陳代謝。豬鼻支原體的脂蛋白LPP可以通過激活NF-κB通路上調(diào)神經(jīng)瘤細胞SHSY5Y鈣蛋白酶抑制蛋白（普遍存在的Ca2+依賴蛋白酶，鈣蛋白酶內(nèi)源性抑制劑）的表達［36］。鈣蛋白酶抑制蛋白是細胞內(nèi)非炎性蛋白，顯著影響細胞正常的生理功能。

3.4 支原體脂蛋白變異對致病力的影響

發(fā)酵支原體的主要特異性抗原-糖甘油磷脂GGPL-III是一種含膽堿磷酸的氨基糖甘油磷脂，能發(fā)生抗原變異［37］。單獨的GGPL-III并不致病，但能加劇一些慢性疾病中的炎癥反應。GGPL-III可以加重小鼠關節(jié)炎和Ni過敏癥。發(fā)酵支原體的脂蛋白在一些慢性疾病中可能存在重要的致病作用。

4 支原體表面多樣化的生物學意義

支原體可變異的蛋白大部分是暴露于表面的脂蛋白，由多基因家族編碼，可以引起宿主強烈的免疫反應。通過基因突變和各種基因變化，使支原體形成多樣化表面。這些可多樣化變異的表面蛋白與宿主間相互作用關系密切，通過修改或除去一些固有元件，迅速的改變支原體表面結構，為支原體提供了一種防御機制。脂蛋白家族通過變異，選擇性的調(diào)節(jié)支原體表面與宿主細胞、環(huán)境間的相互作用，幫助支原體躲避宿主的特異性免疫防御［38］。

5 總結

支原體的種類眾多，可感染的宿主群也很廣泛，即使存在特異性免疫應答，支原體也可引起慢性感染。這些持續(xù)性感染說明支原體和宿主間的相互作用遠比預想的要復雜的多。由于沒有細胞壁，支原體表面的脂蛋白在與宿主的相互作用中發(fā)揮了重要作用。

支原體通過一系列精密的基因變化迅速改變膜結構是它們成功寄生于宿主的主要原因。這些復雜的基因變異可以影響支脂蛋白的表達及結構，發(fā)生相位變異和抗原變異形成了多樣化的支原體表面，幫助支原體躲避宿主的免疫應答，同時這也可能是阻礙疫苗產(chǎn)生保護力的原因之一，導致針對支原體的疫苗在實際生產(chǎn)中效果不佳。

脂蛋白在支原體結構中有重要作用，脂蛋白的結構、性質(zhì)、相位-抗原變異及水平基因轉移等變異，在支原體毒力及致病性中也占有重要作用。對其在支原體毒力、致病性中作用的大小及其作用機制，以及宿主對支原體的變異是否存在選擇性作用等未知問題，還需進一步探索。這些領域的進一步研究將有助于闡明支原體的致病機制。

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