一株螯合球菌HB-4的分離及多相分類鑒定

吳剛 劉洋 李青 杜慧竟 游靖 李紅 柯叢玉 張欣 余吉良 趙婷

（1.華北油田采油工程研究院，任丘 062552；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100027）

螯合球菌屬（Chelatococcus sp.）最早由Auling等［1］于1993年首次提出并描述，并經(jīng)16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析將其歸屬于α-變形菌綱。螯合球菌屬現(xiàn)包含不噬糖螯合球菌（Chelatococcus asaccharovorans）、大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）及Chelatococcus sambhunathii三個(gè)菌種。C. asaccharovorans由Auling等［1］于1993年自蔗糖中分離獲得；C. daeguensis由Yoon等［2］于2008年自印染廠廢水中分離得到；C. sambhunathii由Panday等［3］于2010自溫泉沉積物中分離所得。

本研究所分離與鑒定的螯合球菌HB-4，是本課題組繼大邱螯合球菌HB-1之后，又一自華北油田地層水樣品中分離得到的螯合球菌，該菌對(duì)原油有良好的乳化降解功能、能產(chǎn)生生物表面活性劑、有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物、能夠降低原油黏度，并經(jīng)物模試驗(yàn)證明能夠提高原油采收率（文章待發(fā)表）。

華北油田開(kāi)發(fā)進(jìn)入中后期，增產(chǎn)挖潛的難度不斷加大，僅靠注水開(kāi)發(fā)已很難提高油藏采收率，采用微生物驅(qū)油技術(shù)可提高原油采收率，主要利用微生物的代謝產(chǎn)物對(duì)原油的作用機(jī)理和微生物有效地作用于地層中的殘余油，使剩余在巖石表面、小孔道中的“死原油”變得容易流動(dòng)，從而提高原油采收率。本研究對(duì)HB-4的分類地位進(jìn)行系統(tǒng)準(zhǔn)確的鑒定，旨在為進(jìn)一步了解該菌的驅(qū)油機(jī)理，充分發(fā)揮其生物學(xué)功能，提高原油開(kāi)采效率奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 HB-4分離自河北任丘華北油田地層水。

1.1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 Marker購(gòu)自天為時(shí)代生物有限公司；GoldView購(gòu)自北京塞百盛基因技術(shù)有限公司；溶菌酶購(gòu)自Sigma公司、蛋白酶K購(gòu)自Merk公司；API試劑條購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；其它化學(xué)藥品均為進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB、NA及TSA培養(yǎng)基（成品）均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 取已滅菌的50 mL LB液體培養(yǎng)基加入50 mL油田地層水樣品中，富集菌體培養(yǎng)48 h。采用梯度稀釋法制備10-2-10-6的系列稀釋液，取150 μL分別涂布到NA培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48 h。挑單菌落轉(zhuǎn)接到新鮮的NA斜面上于4℃保藏。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 將菌株HB-4在NA平板上劃線培養(yǎng)，獲得單菌落，觀察其菌落形態(tài)；并利用JEM-1400型透射電鏡（TEM）觀察其菌體形態(tài)特征。

1.2.3 生理生化鑒定 酶活性、碳源利用、糖發(fā)酵產(chǎn)酸和部分生化試驗(yàn)分別使用API ZYM、API 50CH（接種液為API AUX培養(yǎng)基）、API 20E及API 20NE鑒定試劑條按照使用說(shuō)明進(jìn)行操作。生長(zhǎng)溫度、生長(zhǎng)pH值、耐鹽性和抗生素敏感性試驗(yàn)參考Yoon等［2］的方法進(jìn)行。

1.2.4 化學(xué)成分分析

1.2.4.1 脂肪酸的測(cè)定 脂肪酸的測(cè)定方法參照劉洋等［4］的方法進(jìn)行。

1.2.4.2 極性脂的測(cè)定 極性脂的測(cè)定方法參照Liu等［5］的方法進(jìn)行。

1.2.4.3 醌的測(cè)定 醌的提取及純化參照劉洋等［4］的方法進(jìn)行。取凍干菌體約150 mg，加入氯仿∶甲醇=2∶1（V/V）的溶液40 mL，在黑暗處磁力攪拌10 h左右。用濾紙過(guò)濾懼濾液。用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃-45℃減壓蒸餾至干燥，棄餾液。用丙酮溶液1-2 mL重新溶解干燥物，長(zhǎng)條狀點(diǎn)樣于GF254硅膠板（規(guī)格50×200 mm，青島海洋化工廠分廠）上。以甲苯作展層劑展層約20 min，取出風(fēng)干。在波長(zhǎng)254 nm紫外燈下觀察，在綠色熒光背景下呈暗褐色的帶即為泛醌的位置（Rf=0.4）。刮下Rf=0.4的帶，置于5 mL小燒杯中，用1 mL氯仿溶解，然后用細(xì)菌濾器抽濾除去硅膠，收集濾液及洗液，即得泛醌的氯仿溶液。置于4℃黑暗處保存。流動(dòng)相為甲醇：異丙醇溶液，比例為4∶1，流速為1 mL/min，柱溫為40℃，270 nm紫外檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)菌株泛醌組分與洗脫時(shí)間的關(guān)系（參考標(biāo)準(zhǔn)菌株），分析未知菌株。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定

1.2.5.1 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Tiangen公司）提取試驗(yàn)菌株基因組DNA，具體步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取的基因組DNA用0.8%的瓊脂糖進(jìn)行檢測(cè)。以基因組DNA為模板，利用通用引物對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為：正向引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），反向引物1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）［5］。50 μL PCR反 應(yīng)體系：50 ng DNA模板，1×Taq reaction buffer，引物各20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 U Taq酶（Ferments）。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖進(jìn)行檢測(cè)。純化后的PCR產(chǎn)物用ABI3700基因測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測(cè)序結(jié)果用Chromas軟件參照正反序列圖譜人工校對(duì)。將測(cè)序得到的結(jié)果在EzTaxon server 2.1進(jìn)行比對(duì)［6］，確定與已知序列的同源關(guān)系。采用CLUSTAL W進(jìn)行多序列比對(duì)［7］，并利用N-J法通過(guò)MEGA 4軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育及分子進(jìn)化分析［8］。

1.2.5.2 遺傳特征測(cè)定 熱變性法測(cè)定DNA的G+C含量與復(fù)性速率法測(cè)定DNA/DNA同源性參照東秀珠等［9］方法進(jìn)行。參考菌株為大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis） K106T及Chelatococcus sambhunathii HT4T。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征觀察

HB-4細(xì)胞近球狀，1.11 μm×1.28 μm，端生鞭毛1-2根，表面光滑，單個(gè)或成對(duì)排列；革蘭氏陰性，不生孢（圖1）。在TSA培養(yǎng)基上菌落乳白色，圓形，表面凸起，光滑，反光，半透明，邊緣整齊，直徑約為1.0 mm。

圖1 HB-4的透射電鏡細(xì)胞形態(tài)觀察

2.2 生理生化特征鑒定

HB-4具有氧化酶、接觸酶、酯酶（C4）、類脂酯酶（C8）、白氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶活性；最適生長(zhǎng)溫度為37℃；能夠利用24種碳源。對(duì)鏈霉素、氯霉素、氨芐西林、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素及新霉素等抗生素敏感。HB-4生理生化特征具體結(jié)果詳見(jiàn)表1。

2.3 化學(xué)成分分析

表2 HB-4脂肪酸組分分析

圖2 HB-4脂肪酸測(cè)定氣相色譜圖

圖3 HB-4極性脂TLC薄層層析顯色圖

根據(jù)MIDI微生物鑒定系統(tǒng)分析結(jié)果，HB-4主要脂肪酸組成（≥10%）分別為C18：1ω7c （47.01%）和C19：0cyclo ω8c（21.83%），其他組分結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。HB-4的極性脂主要為DPG（diphosphatidylglycerol）、PE（phosphatidylethanolamine）、PG （phosphatidylglycerol）及PC（phosphatidylcholine），見(jiàn)圖3。HB-4的主要呼吸醌組份為Q-10（泛醌-10），約占97%，見(jiàn)圖4。

表1 HB-4生理生化特征

圖4 HB-4泛醌270 nm紫外檢測(cè)結(jié)果

2.4 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

圖5 菌株HB-4 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

利用引物27f和1492r擴(kuò)增得到HB-4的16S rRNA基因序列，序列長(zhǎng)度為1 448 bp，GenBank序列登錄號(hào)為JX658137。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)Blast方法比對(duì)，采用MEGA 4軟件用N-J法構(gòu)建HB-4與相關(guān)模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）。HB-4與Chelatococcus daeguensis K106T及Chelatococcus sambhunathii HT4T聚類在一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支，序列同源性為98%以上，可確定HB-4為Chelatococcus sp.。

2.5 遺傳特征測(cè)定

圖6 E.coli K12 Tm值測(cè)定圖

圖6和圖7分別為對(duì)照菌株（E.coli K12）和HB-4 Tm值的測(cè)定圖。根據(jù)公式計(jì)算，基因組DNA的G+C含量為65.8 mol%，符合Chelatococcus屬的G+C含量的數(shù)值范圍。圖8和圖9為待測(cè)菌株與近緣兩模式菌株同源性的測(cè)定圖，經(jīng)計(jì)算，HB-4同模式菌株Chelatococcus daeguensis K106T及Chelatococcus sambhunathii HT4T的DNA同源性分別為84.9%和47.2%。通過(guò)DNA/DNA（雜交）同源性測(cè)定可以初步判斷HB-4應(yīng)為大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）。

圖7 HB-4 Tm值測(cè)定圖

圖8 HB-4與K106T同源性測(cè)定圖

圖9 HB-4與HT4T同源性測(cè)定圖

3 討論

本研究利用細(xì)菌通用引物對(duì)HB-4的16S rRNA基因序列擴(kuò)增和序列測(cè)定，并通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析比較和利用MEGA 4進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，HB-4被鑒定為螯合球菌屬（Chelatococcus sp.）。以基因系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎(chǔ)，結(jié)合形態(tài)及培養(yǎng)特征、生理生化試驗(yàn)、化學(xué)成分分析及遺傳特征測(cè)定結(jié)果，并綜合參考螯合球菌屬中現(xiàn)存3個(gè)菌種的相關(guān)報(bào)道［1-3］，最終確定HB-4為大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）。

本研究所分離得到的大邱螯合球菌HB-4，是本課題組繼大邱螯合球菌HB-1（文章待發(fā)表）之后，又一自華北油田地層水樣品中分離得到的螯合球菌菌株，其在相關(guān)酶活性及抗生素敏感性等生理生化特征方面與HB-1存在細(xì)微的差異。目前關(guān)于螯合球菌的生物學(xué)功能的研究?jī)H在反硝化作用方面有所報(bào)道［10］，而對(duì)其在石油原油開(kāi)采領(lǐng)域的生物學(xué)功能及其機(jī)制機(jī)理的研究尚鮮有報(bào)道，這方面的研究有待進(jìn)一步深入的開(kāi)展。

微生物的形態(tài)特征是由遺傳物質(zhì)和生存環(huán)境等因素共同決定的，利用基于形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)等技術(shù)的多相分類鑒定方法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于微生物分類學(xué)研究領(lǐng)域［4］。利用微生物多相分類鑒定技術(shù)對(duì)油田地層水HB-4鑒定至“種”水平，確定其準(zhǔn)確的分類地位，為進(jìn)一步了解和發(fā)揮這類螯合球菌的生物學(xué)功能及實(shí)現(xiàn)其生產(chǎn)利用價(jià)值奠定重要的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)自華北油田地層水中分離得到的細(xì)菌HB-4進(jìn)行多相分類學(xué)鑒定，并最終將HB-4鑒定為大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）。該菌株具有一些特殊的生理生化特征及酶學(xué)活性，具有重要的理論研究與實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。

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