鴨脂聯(lián)素基因的單核苷酸多態(tài)性研究分析

張引紅 李慧芳 朱文奇

（1.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，太原 030001；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州 225003）

脂聯(lián)素（Adiponecyin）是20世紀(jì)90年代中期發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細(xì)胞分泌的激素蛋白，并且是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一與肥胖呈負(fù)相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子。脂聯(lián)素在不同的組織中與不同的受體結(jié)合，發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能［1］，如調(diào)節(jié)能量代謝，抵抗炎癥，緩解子宮發(fā)育遲緩等功能。脂聯(lián)素又被稱作Axrp30、apM1、AdipoQ和GBP28，屬于膠原樣血漿蛋白，是脂肪組織高度表達(dá)分泌的一種活性物質(zhì)，其能夠影響機(jī)體處理糖類和脂肪的能力。最早是由Scherer等［2］從小鼠脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的，其后陸續(xù)從人［3］、豬［4］、雞［5］、鴨和牛［6］等中獲得了脂聯(lián)素基因，并克隆了該基因的序列。人和哺乳動物脂聯(lián)素基因包括3個外顯子和2個內(nèi)含子［7］，而禽類由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成［5］。人的脂聯(lián)素基因位于3q27、小鼠位于16號、雞位于9號染色體上，分別編碼244、247和244個氨基酸。目前，已對人和哺乳動物脂聯(lián)素基因結(jié)構(gòu)功能和基因突變等開展了大量的研究工作，已發(fā)現(xiàn)該基因在人上至少存在11個突變位點(diǎn)，該基因啟動子和內(nèi)含子的C/EBP轉(zhuǎn)錄因子在脂肪細(xì)胞分化和調(diào)控脂聯(lián)素基因的表達(dá)起重要作用［8］。但是對禽類脂聯(lián)素基因的研究較晚，相關(guān)研究報道較少。

連接酶檢測反應(yīng)（Ligase detection reaction，LDR）是利用高溫連接酶實(shí)現(xiàn)對基因多態(tài)性位點(diǎn)的識別。通過多重PCR （Multiplex PCR）獲得含有待檢測突變位點(diǎn)的基因片段，高溫連接酶一旦檢測到DNA與互補(bǔ)的兩條寡聚核苷酸接頭對應(yīng)處存在著基因點(diǎn)突變類型的堿基錯配，則連接反應(yīng)就不能進(jìn)行，最后通過測序儀電泳讀取檢測結(jié)果。該技術(shù)屬于中、低通量的SNP分型技術(shù)，較RFLP、SSCP方法具有特異性高、檢測快速、準(zhǔn)確率高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，較DNA測序SnaPshot和HRM成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)運(yùn)用PCR-LDR方法檢測7個鴨種脂聯(lián)素基因的遺傳多態(tài)性，分析該基因T523C SNP位點(diǎn)在不同品種鴨中的遺傳變異情況，旨在為這7個品種鴨的分子標(biāo)記輔助選育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

56只莆田黑鴨、51只連城白鴨、46只紹興鴨、56只攸縣麻鴨、58只建昌鴨、50只北京鴨及80只高郵鴨的血樣均采自各國家級保種場。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 鴨翅靜脈采血，ACD抗凝，酚/氯仿/異戊醇法抽提基因組DNA，TE溶解后-20℃保存。瓊脂糖凝膠電泳初步檢測后，測定DNA濃度及純度OD260/OD280。

1.2.2 PCR-LDR檢測 根據(jù)GenBank的鴨Adiponectin基因序列（DQ452618），針對SNP位點(diǎn)，采用Primer Premier5.0 和Oligo 6.0軟件設(shè)計特異性引物。上游引物Adiponectin T523C-up：5'-ACTCTGTCCCCCAGGTTTG -3'，下游引物Adiponectin T523C-low：5'-AGTAGTAGGTGCCGGGGATG -3'。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括：50 ng/μL模板1.0 μL，1×Buffer緩 沖 液2.0 μL，3 mmol/L Mg2+0.6 μL，2 mmol/L dNTPs 2 μL，1U Taq DNA 聚合酶0.2 μL，1×Q-Solution 4.0 μL，0.5 pmol/L引物混合液2 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性15 min；94℃ 變性30 s，53℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。用3% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，確定其作為模板在LDR反應(yīng)中加入的量。

根據(jù)LDR探針設(shè)計原則［9］設(shè)計LDR的上下游探針，上游探針5'端用磷酸化修飾（表1）。在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積ddH2O稀釋，作為連接反應(yīng)的模板。LDR反應(yīng)體系為：1×Buffer 1 μL，12.5 pmol/L Probe Mix 1 μL，2 U連接酶0.05 μL，100 ng/μL PCR產(chǎn)物1 μL，去離子水6.95 μL。LDR反應(yīng)條件為：94℃ 變性2 min；94℃ 30 s，60℃ 2 min，35個循環(huán)。

表1 LDR檢測探針序列信息

1.2.3 基因分析 取1 μL LDR連接產(chǎn)物與1 μL ABI GS-500 ROX熒光標(biāo)記分子量標(biāo)準(zhǔn)和1 μL去離子甲酰胺上樣液混合，95℃加熱變性2 min，冰中驟冷，于5% 聚丙烯酰胺和5 mol/L 尿素中3 000 V電泳2.5 h，應(yīng)用GENESCANTM672軟件分析膠文件，進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、泳道線校正、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、內(nèi)在分子量標(biāo)準(zhǔn)校正、遷移片段大小測量；應(yīng)用Gen-mapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和基因分型。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 利用Excel 統(tǒng)計7個鴨種Adiponectin基因每種基因型的數(shù)量，運(yùn)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析基因頻率和基因型頻率，并檢驗(yàn)群體內(nèi)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

Adiponectin基因PCR產(chǎn)物片段大小為286 bp與設(shè)計的片段大小一致（圖1）。

2.2 LDR檢測Adiponectin基因型

Adiponectin基因T523C經(jīng)LDR檢測，均顯示為3種峰圖（圖2），即有3種基因型TT、CC和TC?；蚍中蜆?biāo)準(zhǔn)為Adiponectin基因連接產(chǎn)物檢測出雙峰（86±0.5）bp /（88±0.5）bp為TC基因型，單峰（86±0.5）bp為TT基因型，單峰（88±0.5）bp為CC基因。

圖1 Adiponectin基因PCR產(chǎn)物

圖2 Adiponectin-T523C基因分型截圖

2.3 Adiponectin基因頻率、基因型頻率及Hardy-Weinberg平衡分析

由表2可見，7個鴨種均有3種基因型：TT、TC和CC。在莆田黑鴨、紹興鴨、攸縣麻鴨、建昌鴨、北京鴨和高郵鴨中，雜合型占優(yōu)勢，僅在連城白鴨中，TT型占優(yōu)勢。莆田黑鴨、連城白鴨、攸縣麻鴨和北京鴨等位基因T的頻率大于等位基因C的頻率，紹興鴨、建昌鴨和高郵鴨等位基因C的頻率大于等位基因T的頻率。7個鴨種在Adiponectin基因T523C位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。

3 討論

表2 Adiponectin基因及基因型頻率分布

目前，關(guān)于動物脂聯(lián)素基因的研究主要集中在該基因與動物體內(nèi)脂肪沉積、動物生長發(fā)育相關(guān)的研究，本試驗(yàn)采用PCR-LDR方法對莆田黑鴨、連城白鴨、紹興鴨、攸縣麻鴨、建昌鴨、北京鴨和高郵鴨等不同鴨種的Adiponectin基因T523C位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性分析結(jié)果表明，僅在連城白鴨中，TT型占優(yōu)勢。在長期的人工選擇與選配過程中，地方品種在某些基因座上就會漸漸地趨于純合并固定，表現(xiàn)為品種的保守性，而另外一些受選擇壓力相對較小的基因座則可能表現(xiàn)出更豐富的多態(tài)性，表現(xiàn)為品種的變異性。品種的保守性和變異性往往反映了它區(qū)別于另一個品種的種質(zhì)特征。李慧芳等［10］對鴨的生長素基因的多態(tài)性做了分析，在所發(fā)現(xiàn)的3個突變位點(diǎn)中，連城白鴨在這3個位點(diǎn)均與其他8個鴨品種有明顯的差異。這是否與連城白鴨獨(dú)特的種質(zhì)特征有關(guān)，還有待進(jìn)一步分析研究。

不同鴨種Adiponectin基因在523位點(diǎn)處均發(fā)生了T→C的突變，這與董飚等［11］的研究結(jié)果相一致。家禽脂聯(lián)素基因相關(guān)的研究報道甚少，劉大林等［12］在京海黃雞脂聯(lián)素基因內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)C1251T突變（AY786316），該位點(diǎn)對腹脂重有顯著的遺傳效應(yīng)；董飚等［l1］發(fā)現(xiàn)，家鴨脂聯(lián)素基因存在7個單堿基突變；張依裕等［13，14］對鴨脂聯(lián)素基因SNP多態(tài)與鴨肌內(nèi)脂肪等指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析提示，脂聯(lián)素基因?qū)Π子鸱喌闹境练e起重要作用。但此突變位點(diǎn)是否會影響基因的表達(dá)還需進(jìn)一步研究。

從基因型頻率的分布情況來看，本試驗(yàn)中7個鴨種在T523C突變位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05），說明該位點(diǎn)從基因序列保守性來說比較強(qiáng)，在品種的選育、遷徙和遺傳漂變等因素作用下處于動態(tài)平衡當(dāng)中，它們的遺傳是隨機(jī)的，基因頻率的平衡對于群體穩(wěn)定性有著直接的保證作用。再者，國內(nèi)鴨品種選育程度都不高，所以7個鴨種在T523C突變位點(diǎn)均出于遺傳平衡狀態(tài)。

4 結(jié)論

鴨Adiponectin基因T523C位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測與分析表明，7個鴨種均有3種基因型；連城白鴨中TT型占優(yōu)勢，其他品種中均為雜合型占優(yōu)勢；莆田黑鴨、連城白鴨、攸縣麻鴨和北京鴨等位基因T的頻率大于等位基因C的頻率，而其他品種與其相反；7個鴨種在此位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

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