河西絨山羊GOLA-DQA1基因第2外顯子遺傳特征分析

柴文瓊 王繼卿 胡江 劉秀 李少斌 羅玉柱

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 研究測試中心，蘭州 730070）

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）是由緊密連鎖的高度多態(tài)性基因座所組成的染色體上的一個(gè)與免疫應(yīng)答和抗病性密切相關(guān)的多基因復(fù)合體。它廣泛存在于脊椎動(dòng)物中，決定著動(dòng)物的免疫排斥反應(yīng)［1］。MHC基因復(fù)合體由Ⅰ、Ⅱ類和Ⅲ類3類基因組成。Ⅱ類基因包括高度多態(tài)的DQ和DR基因家族，DQ 基因家族至少含有DQA1、DQA2、DQB1和DQB2等4個(gè)基因座位。它們所編碼的MHC抗原在其免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著最重要的作用，與家畜的多種疾病之間存在強(qiáng)相關(guān)。如牛乳房炎、口蹄疫、慢性后脊椎輕癱，綿羊的線蟲、癢病、包蟲病，雞傳染性疾病等［2-6］。山羊的MHC 稱為GoLA（Goat lymphocyte antigen），即山羊白細(xì)胞抗原。山羊GoLA的結(jié)構(gòu)和功能與牛、綿羊非常相似，具有高度多態(tài)性和連鎖不平衡的特點(diǎn)。國內(nèi)外對(duì)山羊GoLA遺傳多態(tài)性的研究主要集中在GoLADRB1和GoLA-DRB3［7-9］基因上，但是尚未見我國優(yōu)良地方山羊品種DQA基因的研究報(bào)道，明顯不利于我國地方山羊品種的合理利用和抗病育種研究。

河西絨山羊是中國固有的三大絨山羊品種之一，現(xiàn)存欄116.8萬只（占甘肅省山羊存欄總量的30.22%），是甘肅省絨山羊生產(chǎn)的重要遺傳資源。但流產(chǎn)嚴(yán)重影響著河西絨山羊的健康發(fā)展。據(jù)課題組對(duì)26 831只河西絨山羊適繁母羊的調(diào)查，河西絨山羊平均流產(chǎn)率達(dá)20%以上。其他學(xué)者也證實(shí)了河西絨山羊流產(chǎn)病的發(fā)生［10］。目前還沒有針對(duì)山羊流產(chǎn)的專用治療藥物，因此只能通過藥物預(yù)防和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理來降低流產(chǎn)率，但使用藥物會(huì)造成畜產(chǎn)品品質(zhì)下降（如羊肉），且和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理一樣，雖然在預(yù)防流產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用，但無法根除它。相同環(huán)境條件下個(gè)體對(duì)山羊流產(chǎn)病的抗性有差異，為從遺傳本質(zhì)上消滅此病提供了理論依據(jù)，但前提是需要找到與流產(chǎn)相關(guān)的抗性等位基因。因此，本研究應(yīng)用PCR-SSCP和測序技術(shù)，以與家畜多種疾病存在強(qiáng)相關(guān)的GOLA-DQA1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，分析河西絨山羊DQA1基因第2外顯子的遺傳特征，探討等位基因頻率與山羊流產(chǎn)的相關(guān)性，以期為河西絨山羊抗流產(chǎn)病分子育種提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 材料

采集864只河西絨山羊血樣記錄是否流產(chǎn)，其中正常個(gè)體610只，流產(chǎn)254只。頸靜脈采血10 mL，ACD抗凝，-20℃保存。采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取血液基因組DNA［11］。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 參照GenBank中山羊DQA1基因第2外顯子序列（AY464657）設(shè)計(jì)1對(duì)引物，由大連寶生物有限公司合成。引物序列見表1。

PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.3 μL，10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）2 μL，10 pmol/μL引物0.4 μL，模板1 μL，加H2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s，60℃ 35 s，72℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠（含EB）檢測，用凝膠成像儀檢驗(yàn)擴(kuò)增效果。

表1 DQA1基因第2外顯子的引物序列、擴(kuò)增長度及退火溫度

1.2.2 SSCP分析及序列測定 取PCR產(chǎn)物2-3 μL，與8 μL加 樣 緩 沖 液（98% formamide，10 mmol/L EDTA，0.025% bro-mophenol blue，0.025% xylenecyanol）混合，98℃變性10 min，立即轉(zhuǎn)置冰上冷卻，加入14%（37.5∶1）的非變性聚丙烯酰胺凝膠，在0.5×TBE、4℃、280 V電壓下，電泳18 h。為保證內(nèi)循環(huán)溫度不受外界溫度影響，電泳在溫控室進(jìn)行。電泳結(jié)束后，采用銀染法顯色，判定等位基因和基因型。

1.2.3 測序 純合子PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司直接進(jìn)行序列測定，雜合子克隆后對(duì)菌液進(jìn)行序列測定。為確保結(jié)果準(zhǔn)確，所有等位基因序列均選擇2個(gè)以上的不同個(gè)體測序2次。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)文獻(xiàn)［12，13］統(tǒng)計(jì)基因型，計(jì)算χ2值、多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）和位點(diǎn)的雜合度（He）。使用SPSS16.0軟件比較河西絨山羊不同等位基因與山羊流產(chǎn)的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果

2.1 DQA1基因第2外顯子PCR-SSCP檢測結(jié)果與序列分析

PCR-SSCP檢測結(jié)果（圖1）顯示，河西絨山羊DQA1第2外顯子共存在A、B、C、D、E、F、G、H、I 9個(gè)等位基因。與GenBank中山羊GOLA-DQA1基因第2外顯子序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GOLA-DQA1*B、GOLADQA1*E和GOLA-DQA1*H 3個(gè)等位基因?yàn)楸狙芯啃掳l(fā)現(xiàn)，Cahi-DQA1.7［14］未在本研究中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)等位基因核苷酸序列比對(duì)結(jié)果（圖2）顯示，河西絨山羊DQA1中發(fā)現(xiàn)42個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，占總分析位點(diǎn)的12.65%（42/332）。其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)23個(gè)，占核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的54.76%（23/42），包括G/A的轉(zhuǎn)換位點(diǎn)15個(gè)，T/C的轉(zhuǎn)換位點(diǎn)8個(gè)；顛換位點(diǎn)13個(gè)，占核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的30.95%（13/42）；轉(zhuǎn)換和顛換共存位點(diǎn)5個(gè)，占11.9%（5/42）；本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)1個(gè)插入位點(diǎn)（17位點(diǎn)）。因此，河西絨山羊DQA1基因第2外顯子多態(tài)性較豐富，轉(zhuǎn)換在核苷酸多態(tài)位點(diǎn)中占優(yōu)勢（54.76%）。

圖1 河西絨山羊GOLA-DQA1基因第2外顯子PCR-SSCP檢測結(jié)果

2.2 DQA1基因第2外顯子遺傳特征分析

河西絨山羊DQA1等位基因頻率（表2）表明，在9等位基因中GOLA-DQA1*G的頻率最高（21.82%），其次是GOLA-DQA1*D和GOLA-DQA1*C，等位基因頻率分別為18.75%和15.16%。等位基因GOLA-DQA1*B和GOLA-DQA1*I的頻率最低，僅分別為4.22%和2.60%。

多態(tài)性分析結(jié)果（表3）表明，河西絨山羊多態(tài)信息含量為0.837 9，屬于高度多態(tài)，雜合度和有效等位基因數(shù)分別為0.421 3和6.879 5，說明河西絨山羊有豐富的遺傳多樣性。經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)，河西絨山羊各基因座位的基因頻率分布明顯偏離Hardy-Weinborg平衡（P<0.01）。

表2 河西絨山羊DQA1基因第2外等位基因頻率

2.3 DQA1基因第2外顯子多態(tài)性與山羊流產(chǎn)關(guān)聯(lián)性分析

經(jīng)SPSS單變量線性模型分析（表4）［15］，病例組與正常組之間的等位基因分布差異顯著（P<0.05），病例組中等位基因GOLA-DQA1*A的頻率顯著高于正常組（P<0.05），等位基因GOLA-DQA1*H的頻率顯著低于正常組（P<0.05）。其余各等位基因頻率無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

表3 DQA1基因第2外顯子群體遺傳結(jié)構(gòu)

表4 河西絨山羊正常組與病例組等位基因頻率

多態(tài)性且多堿基突變是脊椎動(dòng)物MHC的一個(gè)突出特點(diǎn)。與人類、小鼠、牛、豬、綿羊和家禽等相比，山羊MHC遺傳多態(tài)性的研究主要集中在DRB1和DRB3兩個(gè)等位基因［7-9，16］上，結(jié)果表明山羊DRB1、DRB3基因多態(tài)性極為豐富。有關(guān)GoLA-DQA1基因的研究很少，只有Amills等［17］利用PCR-SSCP 方法檢測到7個(gè)等位基因，發(fā)現(xiàn)了23個(gè)氨基酸多態(tài)位點(diǎn)。Zhou 等［18］在GoLA-DQA2中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)等位基因。本研究應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)，在河西絨山羊GoLA-DQA1基因中檢測到9個(gè)等位基因。與GenBank中已有序列相比，本研究在DQA1中新發(fā)現(xiàn)了GoLA-DQA1*B、GoLA-DQA1*E和GoLADQA1*H3個(gè)等位基因，未發(fā)現(xiàn)Cahi-DQA1.7。本研究結(jié)果使DQA1等位基因數(shù)目從7個(gè)增加到9個(gè)。同時(shí)在DQA1中發(fā)現(xiàn)42個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（占總分析位點(diǎn)的12.65%），表明該基因具有高度的多態(tài)性。這主要與河西絨山羊常年生活在海拔1 400-5 564 m的干旱、寒冷、缺氧的嚴(yán)酷條件下，具有的適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、抗病性強(qiáng)等特性有關(guān)。由于地理環(huán)境改變產(chǎn)生的選擇作用產(chǎn)生了物種的多樣性，不同環(huán)境中所接觸的病原體不同，所以其免疫系統(tǒng)要增加遺傳多樣性來應(yīng)對(duì)這種情況，這是MHC對(duì)環(huán)境和病原體的適應(yīng)性的體現(xiàn)。動(dòng)物體只有具有多態(tài)的機(jī)體免疫系統(tǒng)才能適應(yīng)千差萬別的外界環(huán)境。由于動(dòng)物MHC起抗原呈遞作用、與免疫應(yīng)答密切相關(guān)，因此作為主要編碼MHC肽結(jié)合區(qū)（Peptide-binding region，PBR）的DQA1基因也表現(xiàn)為豐富的多態(tài)性。新等位基因的出現(xiàn)可能與其所處的地理環(huán)境和山羊品種有關(guān)。

許多研究表明，DQA1與人類和家畜部分疾病的易感性和抗性有關(guān)，它能誘導(dǎo)強(qiáng)排斥反應(yīng)并參與免疫調(diào)節(jié)［19，20］。Demurov等［21］報(bào)道莫斯科人2型糖尿病與DQA1*0301呈正相關(guān)。Lunden等［22］研究發(fā)現(xiàn)只有一種DQ單倍型與奶牛乳房炎易感性顯著相關(guān)。國外學(xué)者對(duì)高加索人群研究結(jié)果表明，反復(fù)自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）的發(fā)生與單倍型DQA1*0201-DQB1*0201、DQA1*0101-DQB1*0501、DQA1*0501-DQB1*0201相關(guān)［23］。我國林其德等［24］研究上海人群不明原因RSA患者，發(fā)現(xiàn)DQA1*01-DQB1*0604，0605單倍型可能是該病的易感單倍型。本試驗(yàn)結(jié)果表明，GoLA-DQA1不同等位基因?qū)α鳟a(chǎn)的易感性和抗性存在差異。在相同的飼養(yǎng)管理及防疫條件下，不同表型間的等位基因分布差異顯著（P<0.05），病例組中等位基因GoLADQA1*A的頻率顯著高于正常組（P<0.05），等位基因GoLA-DQA1*H的頻率顯著低于正常組（P<0.05）。由此推測等位基因GoLA-DQA1*A與流產(chǎn)的易感性相關(guān)，GoLA-DQA1*H與流產(chǎn)抗性有關(guān)。但需進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)群體樣本量進(jìn)行深入研究，以確定山羊流產(chǎn)的有效分子標(biāo)記，為河西絨山羊抗病育種奠定良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在河西絨山羊GoLA-DQA1基因第2外顯子中檢測到9個(gè)等位基因，其中GoLA-DQA1*B、GoLADQA1*E和GoLA-DQA1*H 3個(gè)為本研究首次發(fā)現(xiàn)。9個(gè)等位基因中存在42個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，占總分析位點(diǎn)的12.65%。其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)23個(gè)，顛換位點(diǎn)13個(gè)，轉(zhuǎn)換和顛換共存位點(diǎn)5個(gè)，插入位點(diǎn)1個(gè)。說明河西絨山羊GoLA-DQA1具有豐富的多態(tài)性。相關(guān)性結(jié)果表明，不同表型間的等位基因分布差異顯著（P<0.05），等位基因GoLA-DQA1*A可能與流產(chǎn)的易感性相關(guān)，GoLA-DQA1*H可能與流產(chǎn)抗性相關(guān)。

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