采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化梨SSR-PCR體系

畢紅園 王長彪 段永紅 郭黃萍 孫毅，5

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801；4.山西農(nóng)科院果樹研究所，太谷 030815；5.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

梨屬于薔薇科（Rosaceae），梨屬（Pyrus L.）植物［1］。全世界梨屬植物約有60種，我國是梨屬植物的起源中心，蘊(yùn)藏著豐富的種質(zhì)資源，原產(chǎn)我國的梨屬植物現(xiàn)有18個(gè)種，7個(gè)亞種，栽培品種約有3 000多個(gè)，栽培面積和總產(chǎn)量在國內(nèi)主要水果中均排第3位［2］。目前，隨著我省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，出現(xiàn)了一批自有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的梨樹新品種和新材料，但由于市場(chǎng)混亂，現(xiàn)有的新品種得不到有效的保護(hù)和鑒定，極大地?fù)p害了相關(guān)單位和個(gè)人的利益，同時(shí)也阻礙了我省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的大力發(fā)展。為此，進(jìn)行梨樹品種間鑒定，保證品種的真實(shí)性和純度，維護(hù)生產(chǎn)者與育種者的利益就顯得尤為重要。近年來，迅速發(fā)展的DNA分子標(biāo)記技術(shù)為優(yōu)良品種的引進(jìn)，品種快速準(zhǔn)確的鑒定和偽劣苗木的早期識(shí)別提供了有效的手段。

已有學(xué)者選用不同的分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)梨開展了研究。其中，SSR標(biāo)記（Simple Sequence Repeat）是一種新興的分子標(biāo)記技術(shù)，可應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域［3］。由于該標(biāo)記分布于整個(gè)基因組，具有數(shù)量豐富，等位變異高，共顯性，檢測(cè)簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)［4］，在品種鑒定等方面已到了廣泛應(yīng)用［5-10］。雖然已有對(duì)梨品種進(jìn)行分子標(biāo)記研究的報(bào)道，但尚未見報(bào)道關(guān)于梨SSR-PCR體系優(yōu)化的研究，并且由于不同的梨品種所要求的體系并不完全相同，因而無法建立一個(gè)完整統(tǒng)一的模式。本次試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)L16（45）方法對(duì)梨SSR-PCR反應(yīng)體系的5因素（Taq DNA 聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的濃度）在4水平上進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)結(jié)果用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行較為詳細(xì)地分析，又用梨的24個(gè)品種對(duì)此體系進(jìn)行檢測(cè)，以期建立一個(gè)較為完整可靠的梨屬SSR-PCR反應(yīng)體系，為梨品種鑒定和新品種保護(hù)提供依分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

“碩豐梨”品質(zhì)優(yōu)良、抗寒性較強(qiáng)，在我省冷涼地區(qū)有較大的種植面積，因而本試驗(yàn)采用“碩豐梨”作為試材。該品種葉片取自山西省農(nóng)科院果樹研究所，采回后置于-70℃冰箱備用。引物參照NCBI網(wǎng)站中梨屬的EST序列，經(jīng)MISA軟件分析，并用Primer3軟件設(shè)計(jì)獲得梨屬SSR標(biāo)記引物，該引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及濃度純度檢測(cè) 梨樹總DNA提取采用改良的CTAB法［11］，在核酸蛋白檢測(cè)儀（SXABRC，eppendorf-Bio-photometer）上 測(cè) 定DNA樣本的濃度及純度。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。將DNA樣品置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR反應(yīng)的因素和水平

表2 PCR反應(yīng)因素水平L16 （45 ）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2 PCR反應(yīng)因素水平的確定與正交表的設(shè)計(jì) 在PCR反應(yīng)中，Taq 聚合酶、Mg2+、dNTP、引物、DNA模板是影響反應(yīng)的5個(gè)主要因素。為確定它們?cè)赑CR反應(yīng)中的最佳水平，針對(duì)這5個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)4個(gè)水平，見表1，采用正交設(shè)計(jì)L16（45）進(jìn)行試驗(yàn)［12，13］。設(shè)計(jì)方案見表2，設(shè)3次重復(fù)，共48個(gè)PCR管，按表中的數(shù)據(jù)加樣；另外每管還加入1 μL的10×PCR Buffer（終濃度為1×PCR Buffer），其余用ddH2O補(bǔ)足，反應(yīng)體系總體積為10 μL。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物的檢測(cè) PCR擴(kuò)增反應(yīng)在東勝創(chuàng)新生物科技有限公司的EDC-810型基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min ；94℃變性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。以上海生物工程有限公司的Marker為對(duì)照，用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，在北京六一儀器廠DYCZ-30C型電泳儀上于300 V恒壓下電泳40 min，拆板后觀測(cè)并拍照分析。參照劉明珍、何正文等［14］的方法，依擴(kuò)增條帶的敏感性和特異性進(jìn)行計(jì)分，分?jǐn)?shù)越高，表示擴(kuò)增帶的敏感性、特異性越好。

1.2.4 最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證 從梨屬的SSR引物中，隨機(jī)選擇1對(duì)引物，對(duì)梨屬24個(gè)品種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證優(yōu)化的梨屬SSR-PCR反應(yīng)的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 DNA質(zhì)量檢測(cè)

SSR標(biāo)記雖然對(duì)DNA的質(zhì)量要求不高，但如果DNA樣品不純則會(huì)影響PCR反應(yīng)，使試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定。本試驗(yàn)采用改良的CTAB法提取梨屬DNA，所提DNA無色透明，可溶性好。用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA溶液純度和濃度，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（0.8%）檢測(cè)DNA的質(zhì)量，觀察到條帶清晰且無降解，說明提取的DNA質(zhì)量高，完整性好，可用于SSR分析（圖1）。

圖1 24個(gè)梨品種的DNA電泳圖

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果直觀分析

2.2.1 梨SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化設(shè)計(jì)及擴(kuò)增結(jié)果 按照表2正交設(shè)計(jì)的16個(gè)處理組合，進(jìn)行PCR反應(yīng)和電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，5種反應(yīng)因素濃度組合不同，其擴(kuò)增的效果也不一。唯一相同的是16個(gè)處理組合都沒有擴(kuò)增出分子量小于100 bp的引物二聚體。其中2、8、14號(hào)處理組合擴(kuò)增效果較差，條帶不清晰且不易觀察；6、15、16號(hào)處理組合擴(kuò)增的條帶目的條帶多且容易觀察。根據(jù)圖片，結(jié)合遺傳多樣性分析的要求，將16個(gè)處理組合分別進(jìn)行打分，即將條帶數(shù)量豐富、清晰度高、背景低的擴(kuò)增產(chǎn)物記為16分，而最差的記為1分。由圖中1-16處理組合可知，條帶數(shù)量最豐富且清晰的是6號(hào)處理組合，賦值為16，幾乎無條帶的13號(hào)處理賦值為1。按此方法對(duì)16個(gè)處理組合分別計(jì)分為4、3、12、13、10、16、5、2、6、7、8、9、1、11、15、14，并對(duì)不同因素與水平的電泳評(píng)分平均值和極差進(jìn)行計(jì)算分析，結(jié)果如表3所示。

圖2 正交體系凝膠電泳圖

極差R值的大小表明各因素影響程度的高低，R越大，說明該因素對(duì)結(jié)果影響越大。因此，該體系中對(duì)結(jié)果影響的大小順序是引物、Mg2+、dNTP、DNA模板、Taq聚合酶。其中，每一因素各水平均值大小K，反映了各因素不同水平對(duì)反應(yīng)體系的影響情況，均值越大說明反應(yīng)水平越好。

表3 正交設(shè)計(jì)直觀分析

2.2.2 各因素濃度對(duì)梨PCR反應(yīng)結(jié)果的影響 由表3可看出，Taq DNA聚合酶濃度處理組合中平均分?jǐn)?shù)最低的是水平3，即Taq DNA聚合酶濃度為1.0 U時(shí)平均分值僅為7.500分；而平均分?jǐn)?shù)最高的是水平4，即Taq DNA聚合酶濃度為1.4 U時(shí)平均分值最高為10.250分，說明1.4 U Taq DNA聚合酶濃度為梨PCR反應(yīng)的適宜濃度。Mg2+處理組合中平均分?jǐn)?shù)最低的是水平1，即Mg2+濃度為1.0 mmol/L 時(shí)平均分值為5.250分；而分?jǐn)?shù)最高的是水平3，即Mg2+濃度為2.0 mmol/L 時(shí)平均分值最高為10.00分，說明2.0 mmol/L Mg2+濃度為梨PCR反應(yīng)的適宜濃度。同理可得出dNTP最優(yōu)濃度為0.1 mmol/L、引物最優(yōu)濃度為0.5 μmol/L、DNA模板最優(yōu)濃度為50 ng。

2.3 最佳反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測(cè)

應(yīng)用上述正交試驗(yàn)所獲得的最佳反應(yīng)體系，用1對(duì)引物對(duì)梨屬24個(gè)品種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖3顯示，每份DNA樣品均能擴(kuò)增出清晰的目的條帶。說明該體系比較穩(wěn)定，適用于梨屬植物遺傳多樣性的SSR標(biāo)記研究。

圖3 最佳體系的24個(gè)梨品種電泳圖

3 討論

為了對(duì)梨進(jìn)行遺傳多樣性研究，需要獲得高質(zhì)量的DNA。而梨的葉片中也存在大量的糖、酚類等物質(zhì)，因而用傳統(tǒng)的CTAB法所提取的梨DNA質(zhì)量效果不太好，改良后的CTAB法可將細(xì)胞中的多糖，多酚去除，效果較好。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)以其便捷可操作性高，重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，近年來在植物的種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性檢測(cè)、親緣關(guān)系分析和遺傳圖譜構(gòu)建等方面得到廣泛應(yīng)用。但SSR-PCR 反應(yīng)體系同樣受到dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、DNA模板用量等因素的影響，例如，模板濃度過低會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定及條帶模糊；濃度過高時(shí)引物與dNTPs過早耗盡，結(jié)果也不穩(wěn)定。引物濃度偏高會(huì)引起堿基錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生，形成引物二聚體。而Taq酶的濃度過高不僅增加試驗(yàn)成本，而且極易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；濃度過低則會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的合成效率下降［15］。同時(shí)，Taq DNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，對(duì)Mg2+濃度非常敏感。并且dNTP分子中的磷酸基團(tuán)能定量地與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低［16］。因而確定其最優(yōu)體系，對(duì)PCR反應(yīng)是否成功、所得的結(jié)果是否準(zhǔn)確，以及PCR的擴(kuò)增效率都有重要的影響［17］。

傳統(tǒng)的單因素試驗(yàn)篩選反應(yīng)體系，需要進(jìn)行多次的梯度試驗(yàn)，試驗(yàn)繁瑣［18］，但是正交試驗(yàn)因在減少試驗(yàn)規(guī)模的同時(shí)又不損失信息，能更加快速找到最優(yōu)組合［19］，同時(shí)也可借助于數(shù)學(xué)上的統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析與處理，獲得可靠的結(jié)論，使分析結(jié)果更科學(xué)、完善和簡(jiǎn)便。不過不能忽視的是該方法也有不足，對(duì)照?qǐng)D片進(jìn)行打分法，存在一定的主觀性，因而也需要有進(jìn)一步的改進(jìn)。

4 結(jié)論

最終確立梨SSR-PCR最佳的反應(yīng)體系（10 μL）為：1.0 μL 10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶1.4 U、Mg2+2.0 mmol/L、DNA模板50 ng、dNTPs 0.1 mmol/L、引物0.5 μmol/L。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min ；94℃變性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。用此反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序在24份梨品種材料中獲得的結(jié)果清晰穩(wěn)定，重復(fù)性好。因而初步確定此反應(yīng)體系可用于梨屬植物的PCR擴(kuò)增分析。

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