中國林蛙核糖核酸酶Rdrlec的原核表達(dá)及抗菌活性檢測(cè)

尹雪薇 彭艷麗 冉帥 陶鳳云

（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023）

近年來，抗菌及抗腫瘤的核糖核酸酶作為多功能分子引起了廣泛的關(guān)注，這方面的研究相當(dāng)活躍，成為新藥開發(fā)的熱點(diǎn)［1-4］。來源于家雞（Gallus gallus）的兩個(gè)RNase A超家族成員RNase A-1和A-2具有81%氨基酸序列一致性，等電點(diǎn)分別是10.2和11.0，其中具有較高等電點(diǎn)的RNase A-2具有顯著的殺菌活性，而RNase A-1沒有殺菌活性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，RNase A-2中的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，Domain II（TTRRHFRIT）和Domain III（RYSGNQFNRRVRVGCRG）對(duì)該分子的殺菌活性具有重要貢獻(xiàn)，可以不依賴于分子骨架而以單獨(dú)肽段形式發(fā)揮殺菌活性［5］。來源于魚類的多個(gè)RNase A超家族成員都發(fā)現(xiàn)具有殺菌活性［6，7］，大腸桿菌外膜蛋白酶OmpT可以特異性地裂解斑馬魚ZF-RNase-3分子中的Arg-Arg肽鍵，釋放出2個(gè)肽段，其中的大片段（氨基酸31-124）是有效的殺菌劑［8］。中國林蛙核糖核酸酶Rdronc分子中處于正選擇壓力下的帶有正電荷的氨基酸殘基對(duì)于殺菌活性具有重要作用［2］。由于核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）超家族成員數(shù)量眾多，氨基酸序列變異很大，有假說認(rèn)為該超家族成員可能起源于宿主防御功能［6］，驗(yàn)證這一假說需要來源于不同物種的多種RNase A超家族成員具有殺菌活性的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

中國林蛙核糖核酸酶Rdrlec基因是本實(shí)驗(yàn)室從中國林蛙基因組中PCR擴(kuò)增得到的495 bp的核苷酸片段，包含信號(hào)肽序列和完整的成熟蛋白編碼區(qū)序列。Blast檢索顯示此序列與多條來源于蛙屬的核糖核酸酶同源，其中與來源于日本蛙的核糖核酸酶Rjlec （protein ID：P18839），具有最高的氨基酸序列一致性（81%），我們將新基因命名為Rdrlec，提交到GenBank （登錄號(hào)EU384704）。

為了進(jìn)一步開發(fā)利用這一新的基因資源，探索其編碼的蛋白產(chǎn)物的生物學(xué)活性，我們將此基因按照大腸桿菌偏好的密碼子進(jìn)行優(yōu)化后，人工合成基因，定向克隆到pET-28a（+）構(gòu)建重組表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。通過包涵體復(fù)性、腸激酶切割融合蛋白、Ni-NTA親和層析純化等步驟獲得了野生型Rdrlec重組蛋白，并檢測(cè)其抗微生物活性，旨在為該分子的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)載體pET-28a （+）、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3） 、藥敏測(cè)試大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均由北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏；Pfu DNA 聚合酶、DNA 片段純化試劑盒均購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III等購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購自天根生化科技（北京）有限公司；LB 培養(yǎng)基購自美國BD公司；Ni-NTA介質(zhì)購自Qiagen；重組腸激酶購自Novagen公司。TritonX-100 購自Sigma 公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 Rdrlec基因序列的優(yōu)化、合成與PCR擴(kuò)增 根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性及密碼子的合理搭配設(shè)計(jì)Rdrlec的基因序列，在基因的N端添加腸激酶裂解位點(diǎn)，在C端添加連續(xù)2個(gè)終止密碼子，在上述序列的兩端分別引入EcoR I和Hind III限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的核苷酸序列由生工生物工程（上海）有限公司合成，并克隆在pUC57質(zhì)粒上，命名為pUC57-Rdrlec，保存在大腸桿菌DH5α中。

根據(jù)以上的序列設(shè)計(jì)兩條特異性PCR擴(kuò)增Rdrlec的引物：5'-CCCGAATTCGACGATGATGACAAACAG-3'和5'-GGCAAGCTTGTCATTAACAGCTACCG-3'，下劃線部分依次為EcoR I和Hind III限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，其兩側(cè)添加了保護(hù)性堿基以提高限制酶切割效率。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

以pUC57-Rdrlec為模板，PCR擴(kuò)增Rdrlec基因片段，PCR條件為：94℃ 預(yù)變性5 min；94℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 50 s，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行3. 0% 瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)基因片段。

1.2.2 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將純化回收的PCR產(chǎn)物和pET-28a （+）載體均用EcoR I和Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳分離并切膠純化后，使用T4 DNA 連接酶在16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒，分別用EcoR I單酶切重組表達(dá)載體，及用EcoR I和Hind III雙酶切重組表達(dá)載體，進(jìn)行酶切驗(yàn)證后，重組質(zhì)粒命名為pET28a-Rdrlec，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，獲得工程菌BL21（DE3）/ pET28a-Rdrlec。挑單菌落接種于LB培養(yǎng)液（50 μg/mL卡那霉素），37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按10%轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素的新鮮液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8時(shí)，加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，降低培養(yǎng)溫度至34℃，誘導(dǎo)6 h后，8 000 r/min離心15 min收集菌體，用PBS洗3次，取少量樣品采用SDS-PAGE （5%分離膠，15%濃縮膠）檢測(cè)重組蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 重組融合蛋白的純化 離心收集細(xì)胞，洗滌去除培養(yǎng)基，將菌體重懸于裂解液（20 mmol/L Tris·HCl （pH8.0），0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，0.5% Triton X-100）中，在冰浴條件下超聲破碎菌體（超聲5 s，間隔5 s，50 次循環(huán)，功率300 W），接著4℃、15 000 r/min離心30 min收集包涵體。將包涵體用洗滌液［1%（V/V）Triton X-100，1 mol/L NaCl］充分洗滌后，溶于尿素變性緩沖液（8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris，pH7.5，25 mmol/L DTT）中，室溫下溶解2 h。離心除去沉淀，將蛋白濃度控制在50 μg/mL，在復(fù)性緩沖液（含有 0.10 mol/L NaCl，3.0 mmol/L 還原型谷胱甘肽，0.6 mmol/L 氧化型谷胱甘肽的 0.10 mol/L Tris-乙酸緩沖液，pH8.0）中4℃復(fù)性40 h。

離心收集上清，用超濾管濃縮（截流相對(duì)分子質(zhì)量3 kD）后，透析，進(jìn)行Ni-NTA親和層析，用60 mmol/L咪唑充分洗去雜蛋白后，用500 mmol/L咪唑洗脫目標(biāo)融合蛋白。

1.2.5 腸激酶切割融合蛋白釋放Rdrlec 將純化的融合蛋白透析后，利用腸激酶進(jìn)行酶切，以釋放Rdrlec。反應(yīng)體系為：10×rEK Cleavage buffer 5 μL，融合蛋白50 μg，重組腸激酶4 μL（1 U/μL），去離子水補(bǔ)充至總體積50 μL，25℃溫浴酶切反應(yīng)24 h，取樣SDS-PAGE分析酶切效果。將酶切后的溶液上樣于Ni-NTA柱，載體序列由于帶有6×His標(biāo)簽，特異性吸附到層析介質(zhì)上，而Rdrlec存在于穿過液中。收集Rdrlec部分，透析并凍干濃縮后，再次進(jìn)行Sephadex G75層析純化Rdrlec。進(jìn)行15% SDSPAGE檢測(cè)酶切和純化效果。

1.2.6 Rdrlec的酶活性 參考文獻(xiàn)方法［2，9］，酶活性的檢測(cè)基于核糖核酸酶降解酵母總RNA的反應(yīng)。將純化的酵母總RNA底物溶解在反應(yīng)緩沖液（40 mmol/L乙酸鈉，pH6.0）中。反應(yīng)總體積為0.8 mL，含有0.8 mg RNA底物。將重組Rdrlec加入到反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng)4 h，然后添加0.5 mL冰冷的20 mmol/L硝酸鑭和3%高氯酸終止反應(yīng)。在室溫下13 000 r/min離心除去未降解的RNA，通過OD260值檢測(cè)溶解于上清液中的RNA降解產(chǎn)物的量，分別以RNase A和乙酸鈉緩沖液作為酶活性檢測(cè)的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.2.7 Rdrlec的抗菌活性 將斜面保存的Escherichia coli和Staphylococcus auteus分別進(jìn)行LB固體平板劃線，挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床中培養(yǎng)至指數(shù)生長期后，連續(xù)10倍稀釋涂平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度為（1-5）×106作為測(cè)試菌液。取不同濃度的重組蛋白用10 mmol/L pH7.4的磷酸鈉緩沖液連續(xù)10倍稀釋后取5 μL 加入到20 μL 菌懸液中，對(duì)照組加入等量的磷酸鈉緩沖液。37℃培養(yǎng)4 h，使重組蛋白發(fā)揮殺菌作用。處理后的菌懸液連續(xù)10倍稀釋，涂LB瓊脂平板，做3個(gè)重復(fù)，37℃過夜培養(yǎng)后計(jì)數(shù)菌落形成單位，計(jì)算細(xì)菌存活數(shù)，并繪制曲線。

2 結(jié)果

2.1 Rdrlec基因的優(yōu)化與PCR擴(kuò)增

由于Rdrlec基因（GenBank EU384704）來源于兩棲動(dòng)物蛙類含有大腸桿菌稀有密碼子，會(huì)影響其在大腸桿菌中的高效表達(dá)，首先使用稀有密碼子計(jì)算 器（Rare Codon Calculator，http：//nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/）對(duì)Rdrlec成熟肽對(duì)應(yīng)的基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)序列中共有10個(gè)稀有密碼子（5個(gè)精氨酸稀有密碼子，3個(gè)異亮氨酸稀有密碼子和2個(gè)脯氨酸稀有密碼子），如圖1中下劃線所示。為了提高重組蛋白的表達(dá)量，對(duì)該序列進(jìn)行了優(yōu)化，原則是首先根據(jù)表達(dá)物種的密碼子頻率進(jìn)行調(diào)整，以使基因序列的密碼子使用頻率盡可能的與物種的最優(yōu)密碼子頻率一致，去掉了頻率在10%以下的密碼子；然后盡可能降低序列中的堿基重復(fù)結(jié)構(gòu)，使RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定；同時(shí)使整個(gè)DNA序列的G+C含量盡可能接近50%。優(yōu)化后的序列與優(yōu)化前序列比對(duì)結(jié)果如圖1。

分別在優(yōu)化后的Rdrlec基因的N端添加腸激酶裂解位點(diǎn) （DDDDK）及在C端添加連續(xù)2個(gè)終止密碼子 （TAATGA），可以使表達(dá)出的融合蛋白經(jīng)過腸激酶裂解后得到具有天然N 末端和C末端的重組蛋白；在上述序列的兩端分別引入EcoR I和Hind III限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，可使該基因片段定向連接到pUC57載體相應(yīng)的多克隆位點(diǎn)處。以pUC57-Rdrlec為模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶和目的基因特異性引物PCR擴(kuò)增出目的基因片段，其分子量大約為370 bp（圖2），與理論值相符。

圖1 密碼子優(yōu)化前后的序列比對(duì)

圖2 PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，重組表達(dá)載體pET28a-Rdrlec大小約為5 700 bp，雙酶切后得到約5 350 bp的載體大片段和約360 bp的目的基因片段，片段大小與理論值相符，初步表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果顯示載體中的基因序列和設(shè)計(jì)序列完全一致，且閱讀框架正確，重組表達(dá)載體pET28a-Rdrlec構(gòu)建成功。

圖3 EcoR I 和Hind III雙酶切鑒定重組表達(dá)載體pET28a-Rdrlec

2.3 重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體pET28a-Rdrlec轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21（DE3），在含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，并降低誘導(dǎo)溫度至34℃誘導(dǎo)重組融合蛋白表達(dá)，分別取誘導(dǎo)0 h和6 h的菌液，SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物（圖4），誘導(dǎo)6 h后的工程菌在約17 kD處有一條明顯的新生的重組蛋白表達(dá)條帶，與重組融合蛋白的預(yù)期分子量值（16.7 kD）相符，而未誘導(dǎo)的工程菌在相應(yīng)位置處無相應(yīng)的蛋白條帶。分析菌體經(jīng)超聲波裂解后的上清和沉淀（圖4中泳道6，7），可見重組蛋白大部分分布在沉淀中，以包涵體形式表達(dá)。

SDS-PAGE顯示（圖4中泳道3），Ni-NTA親和層析后重組融合蛋白得到了有效的純化。

將純化后的融合蛋白用腸激酶裂解，釋放Rdrlec蛋白，電泳結(jié)果（圖4中泳道4）顯示，酶切效果理想，釋放出分子量約12.3 kD的Rdrlec蛋白和分子量約4.4 kD的載體融合肽。腸激酶裂解產(chǎn)物再次進(jìn)行Ni-NTA親和層析，由于載體融合肽帶有6×His標(biāo)簽而結(jié)合在層析介質(zhì)上，而Rdrlec蛋白則流出層析柱。將流出液中的Rdrlec蛋白透析后凍干，溶解于pH6.0 的40 mmol/L乙酸鈉緩沖液中，電泳顯示（圖4中泳道5），Rdrlec重組蛋白得到了有效的純化。

圖4 重組蛋白表達(dá)及純化產(chǎn)物電泳檢測(cè)

2.4 Rdrlec的酶活性

重組Rdrlec具有酶活性，其酶活性弱于RNase A，但是顯著高于乙酸鈉陰性對(duì)照組（圖5）。由于核糖核酸酶的活性依賴于分子正確的空間結(jié)構(gòu)，因此可以推測(cè)Rdrlec重組蛋白已經(jīng)正確折疊。

2.5 Rdrlec重組蛋白的抗菌活性

Rdrlec重組蛋白對(duì)測(cè)試的兩種菌均具有顯著的抗菌活性（圖6），其中對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)，在Rdrlec重組蛋白濃度為2 μmol/L時(shí)，菌落數(shù)下降約5個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用其次，菌落數(shù)下降約3個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖5 Rdrlec重組蛋白的酶活性與RNase A比較

圖6 Rdrlec重組蛋白的抗菌性

3 討論

為了探索Rdrlec這一新基因編碼的蛋白產(chǎn)物的功能，我們利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白。由于有活性的重組蛋白在表達(dá)過程中可能對(duì)宿主細(xì)胞有毒害，因此采用包涵體形式表達(dá)。包涵體主要由目的蛋白構(gòu)成的，但是由于錯(cuò)誤折疊形成無活性、不溶的蛋白聚集體，包涵體與細(xì)胞質(zhì)成分明顯分開，細(xì)胞破碎之后仍以顆粒形式存在。包涵體內(nèi)絕大多數(shù)成分是蛋白質(zhì)，雜質(zhì)主要是一些外膜蛋白、質(zhì)粒DNA、核糖體元件、脂質(zhì)、肽聚糖和脂多糖等。包涵體的形成對(duì)于重組蛋白的生產(chǎn)提供了幾個(gè)有利的因素：包涵體具有高密度，易于通過低速離心分離純化；包涵體有較強(qiáng)的抗酸堿、抗蛋白酶的能力，有利于保護(hù)重組蛋白免受外界強(qiáng)烈作用的破壞而降解損失；可用于生產(chǎn)天然構(gòu)象時(shí)對(duì)宿主細(xì)胞有毒害的蛋白質(zhì)。

由于基因表達(dá)水平與偏好密碼子的使用程度之間存在強(qiáng)的相關(guān)性，因此為了提高重組蛋白的表達(dá)效率，我們采用大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行了基因全序列優(yōu)化和人工合成。同時(shí)，由于天然N 端對(duì)抗菌肽的生物活有決定性作用，為了保證所表達(dá)的重組蛋白具有天然N 端，我們?cè)诳咕幕虻腘 端添加了腸激酶識(shí)別序列。

本研究表達(dá)出的中國林蛙核糖核酸酶Rdrlec重組蛋白具有明顯的抗菌作用，對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌表現(xiàn)出不同的抗菌活性，這可能與細(xì)菌細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)組成有關(guān)。不同的細(xì)菌外膜組成上存在差異，使表面的負(fù)電荷表現(xiàn)差異，對(duì)同一種蛋白的結(jié)合能力造成差異［10］?？咕鞍妆匦璐┻^胞外基質(zhì)、細(xì)胞壁肽聚糖層等到達(dá)細(xì)胞質(zhì)膜。按照膜裂解型或非膜裂解型方式作用質(zhì)膜［11］，目前發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)抗菌蛋白是通過損傷質(zhì)膜的膜裂解型方式作用于細(xì)胞?？咕鞍椎恼姾蓡?dòng)與質(zhì)膜的結(jié)合，雙親α螺旋或β折疊的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)膜脂雙層的插入或破壞。

中國林蛙核糖核酸酶Rdrlec作為一種有效的抗菌蛋白，為抗微生物感染提供了新的候選藥物分子，在醫(yī)藥、食品防腐和動(dòng)物飼料添加劑等領(lǐng)域可能具有應(yīng)用的潛力。

4 結(jié)論

按照大腸桿菌偏好的密碼子合成Rdrlec基因，并在目的基因的N端添加腸激酶切割位點(diǎn)，同時(shí)在C端添加終止密碼子，通過EcoR I和Hind III限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)將目的基因定向克隆到pET-28a（+）表達(dá)載體中，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)出帶有6×His標(biāo)簽的融合蛋白，利用Ni-NTA親和層析純化融合蛋白后，經(jīng)過腸激酶切割，獲得具有抗菌活性的不帶有額外氨基酸序列殘留的Rdrlec重組蛋白，重組蛋白具有水解RNA的酶活性，說明形成了正確的空間結(jié)構(gòu)，重組蛋白對(duì)對(duì)測(cè)試的革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌均具有顯著的抗菌活性，提示中國林蛙核糖核酸酶Rdrlec可能在抗微生物感染中發(fā)揮作用。

［1］ 陶鳳云, 趙偉, 馬潤宇. 核糖核酸酶A超家族成員殺菌作用研究進(jìn)展［J］. 中國抗生素雜志, 2009, 34（6）：321-325, 379.

［2］ Tao F, Fan M, Zhao W, et al. A novel cationic ribonuclease with antimicrobial activity from Rana dybowskii［J］. Biochem Genet, 2011, 49 （5-6）：369-384.

［3］ 陶鳳云, 趙偉, 林強(qiáng), 等. 中國林蛙卵核糖核酸酶的分離純化及其抗腫瘤作用［J］. 中國生物工程雜志, 2010, 30（5）：103-109.

［4］ Lee I. Ranpirnase （Onconase）, a cytotoxic amphibian ribonuclease, manipulates tumor physiological parameters as a selective killer and a potential enhancer for chemotherapy and radiation in cancer therapy［J］. Expert Opin Biol Ther, 2008, 8 （6）：813-827.

［5］ Nitto T, Dyer KD, Czapiga M, et al. Evolution and function of leukocyte RNase A ribonucleases of the avian species, Gallus gallus［J］. J Biol Chem, 2006, 281：25622-25634.

［6］ Cho S, Zhang J. Zebrafish ribonucleases are bactericidal：implications for the origin of the vertebrate RNase A superfamily［J］. Mol Biol Evol, 2007, 24 （5）：1259-1268.

［7］ Pizzo E, Varcamonti M, Di Maro A, et al. Ribonucleases with angiogenic and bactericidal activities from the Atlantic salmon［J］. FEBS J, 2008, 275 （6）：1283-1295.

［8］ Zanfardino A, Pizzo E, Di Maro A, et al. The bactericidal action on Esch-erichia coli of ZF-RNase-3 is triggered by the suicidal action of the bacterium OmpT protease［J］. FEBS J, 2010, 277：1921-1928.

［9］ Rosenberg HF. Recombinant human eosinophil cationic protein. Ribonuclease activity is not essential for cytotoxicity［J］. J Biol Chem, 1995, 270 （14）：7876-7881.

［10］ Papo N, Shai Y. Can we predict biological activity of antimicrobial peptides from their interactions with model phospholipid membranes? ［J］. Peptides, 2003, 24 （11）：1693-1703.

［11］ Powers JP, Hancock RE. The relationship between peptide structure and antibacterial activity［J］. Peptides, 2003, 24 （11）：1681-1691.