骨癌痛大鼠脊髓背角TRESK 表達水平的變化＊

張登文， 吳煥兵， 張傳漢， 夏 輝， 徐 林， 姚文龍， 田玉科， 王學(xué)仁△

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院麻醉學(xué)教研室，武漢 430030

2武警湖北省總隊醫(yī)院麻醉科，武漢 430061

醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步大大提高了癌癥患者的5年生存率。隨之凸現(xiàn)的問題是癌癥引起的疼痛嚴(yán)重影響著患者生活質(zhì)量，其中以骨癌痛為典型代表。骨癌痛一般是由原發(fā)性的腫瘤或其他部位的腫瘤轉(zhuǎn)移所引起的痛覺過敏、痛覺超敏，具有自發(fā)性。TRESK（TWIK－related spinal cord K＋channel）是近年新發(fā)現(xiàn)的一種雙孔鉀通道，它主要定位于脊髓和背根神經(jīng)節(jié)，是一種重要的背景鉀離子通道。最近發(fā)現(xiàn)TRESK 的突變與家族性偏頭痛有關(guān)［1］。但是TRESK 在骨癌痛發(fā)生與維持過程中的作用并不十分清楚。因此，本研究擬觀察骨癌痛大鼠脊髓背角TRESK 的表達變化，為進一步探討骨癌痛的發(fā)病機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雌性SD 大鼠12只，體重150～180g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供，飼養(yǎng)于同濟醫(yī)院實驗動物中心，室溫20～24℃，濕度約60%。將大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham 組）和骨癌痛組（BCP組），每組6只大鼠。

1.2 骨癌痛大鼠模型的制備

大鼠用10%水合氯醛麻醉后（3mL／kg），仰臥固定于操作臺上，備皮后碘伏消毒右側(cè)后肢皮膚，于脛骨上段切開皮膚，鈍性分離肌肉骨膜組織，暴露脛骨，在脛骨結(jié)節(jié)下方0.5～1.0cm 處的脛骨平臺上用23G 的注射器針頭垂直鉆孔至骨髓腔，再用20 μL微量注射器將10μL Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞（3×104個）懸液緩慢注入骨髓腔內(nèi)。注射完畢后，用醫(yī)用骨蠟封住針孔，消毒皮膚切口，局部給予少許青霉素后縫合肌肉、皮膚。Sham 組大鼠予骨髓腔內(nèi)注射10μL的D－Hanks液。

1.3 機械痛閾測定

各組大鼠在手術(shù)前1d測定基礎(chǔ)機械縮足閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT），取平均值為基礎(chǔ)值。各組大鼠均在術(shù)后3、5、9、14d，用Von－Frey纖維絲（美國Stoeling公司）以up－down法［2］測定術(shù)側(cè)的MWT。

MWT 的測定：將大鼠置于一透明玻璃箱內(nèi)，待其適應(yīng)20min后，用Von－Frey纖維絲垂直刺激大鼠右后肢足底皮膚表面，持續(xù)時間≤6s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。首次測定從2g開始，當(dāng)該力度的刺激不能引起陽性反應(yīng)時，給予大一級力度的刺激；如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予小一級力度的刺激，如此連續(xù)進行，直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測定4 次。最大力度為15g，大于此值時記為15g。每次刺激間隔30s。

1.4 KATP通道的免疫組織化學(xué)染色

術(shù)后14d，大鼠分別用10%水合氯醛麻醉后，行左心室－主動脈插管，依次用4℃生理鹽水200mL及含4%多聚甲醛400mL灌流。取腰膨大段脊髓，4%多聚甲醛后固定，30%蔗糖脫水至組織沉底后，行冰凍切片，片厚20μm。PBS漂洗5 min×3次，山羊血清封閉15 min 后加入兔抗鼠TRESK（1∶200），4℃過夜。PBS漂洗5min×3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶100）孵育1h，PBS 漂洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Western blot檢測

術(shù)后14d，每組取4只大鼠，麻醉后處死，取脊髓腰膨大組織，用RIPA 裂解液提取組織總蛋白，并用分光光度儀測定蛋白濃度。將100μg的蛋白用5%的濃縮膠及10%的分離膠進行電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫下封閉1h，一抗（TRESK 1∶500，GAPDH 1∶5 000）4℃孵育過夜，洗膜后辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫下孵育1h。漂洗后加入ECL 發(fā)光試劑，用BIORAD GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)進行成像分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 機械痛閾值的變化

兩組大鼠術(shù)前MWT 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；BCP 組在手術(shù)后5d機械痛閾值開始降低，與Sham 組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠不同時點機械縮足閾值的變化（g，±s，n＝6）Table 1 The changes of MWTs of rats at different time points（g，±s，n＝6）

表1 各組大鼠不同時點機械縮足閾值的變化（g，±s，n＝6）Table 1 The changes of MWTs of rats at different time points（g，±s，n＝6）

與Sham 組比較，＊P＜0.05；與手術(shù)前1d比較，＃P＜0.05

術(shù)后時間（d）組別術(shù)前1d 3 5 9 14 Sham 15.0±0.3 14.3±1.2 15.2±0.9 14.8±1.2 15.1±1.3 BCP 14.6±0.7 14.1±1.9 8.3±0.7＊＃6.4±0.9＊＃3.2±0.4＊＃

2.2 TRESK 蛋白的表達

如圖1所示，TRESK的表達主要位于脊髓背角。Western blot檢測結(jié)果也顯示，BCP組的TRESK 蛋白的表達較Sham 組明顯減少（P＜0.05），見圖2。

圖1 大鼠脊髓腰膨大術(shù)側(cè)背角組織TRESK 免疫熒光染色（A、C：×40，B、D：×200）Fig.1 Immunofluorescence staining of TRESK in the spinal dorsal horn of rats（A，C：×40，B，D：×200）

圖2 大鼠脊髓腰膨大術(shù)側(cè)背角組織TRESK 表達變化Fig.2 The changes in expression of TRESK in rat spinal dorsal horn

3 討論

向脛骨骨髓腔注入Walker 256 乳腺癌細(xì)胞制備大鼠脛骨癌痛模型是比較成熟的骨癌痛模型［3］。本研究結(jié)果表明，在接種癌細(xì)胞5d后大鼠的機械痛閾值開始明顯降低，表明模型制備成功。

骨癌痛機制復(fù)雜。脊髓背角是疼痛信息傳遞和整合的初級中樞，也是機體對于傷害性信息進行自身調(diào)制或整合的重要位點之一。目前研究認(rèn)為脊髓中樞敏化在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中起著重要的作用。中樞敏化是指傷害性刺激傳入引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛傳遞神經(jīng)元興奮性增高及突觸的可塑性改變［4］。神經(jīng)元興奮性增高導(dǎo)致一些本不該產(chǎn)生自發(fā)放電活動的部位產(chǎn)生自發(fā)放電現(xiàn)象，即異位放電。

鉀離子通道的生理作用是維持細(xì)胞膜的靜息電位，使動作電位復(fù)極化，決定著神經(jīng)元的放電頻率等。抑制鉀通道可以使異位放電的頻率增加，提示鉀通道參與了異位放電的形成。Everill等［5］發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)損傷后，受損的DRG 大神經(jīng)元的鉀電流明顯下調(diào)，其中IA 降低60%，IK 降低65%，ID 無明顯變化。同時在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)開胸術(shù)后大鼠胸段脊髓背角神經(jīng)元中的ATP敏感性鉀離子通道的表達是降低的，在坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠模型中也得到同樣的結(jié)果［2，6］。

TRESK，雙孔微弱的內(nèi)向整流鉀通道（TWIK）相關(guān)的脊髓鉀通道，是近年新發(fā)現(xiàn)的一種雙孔鉀離子通道（K2P），它與其他的鉀離子通道包括電壓門控（Kv）、鈣激活（Kca）和內(nèi)向整流器（Kir）通道在分子結(jié)構(gòu)、電生理和藥理性質(zhì)方面區(qū)別很大。K2P 的離子選擇通道亞基由4次跨膜（TMA1－4）和雙孔形成區(qū)（P1，P2）組成，而其它的鉀通道亞基由2、6或8次跨膜片段和一個保守孔形成區(qū)組成。K2P電流在所有的細(xì)胞膜電位中都能觀察到，而且能被電壓躍階即時地激活且沒有顯示激活所需的電壓閾值，這也是能把它們從其它的鉀電流中辨別出來的原因。因此，它能產(chǎn)生漏電流來幫助形成和穩(wěn)定靜息電位并且在生理條件下影響細(xì)胞興奮性［7－8］。TRESK主要定位于脊髓和背根神經(jīng)節(jié)，是一種重要的背景鉀離子通道［9］。Kang等［10］發(fā)現(xiàn)在24℃時背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元主要的背景鉀離子通道是TRESK。Lafreniere等［1］發(fā)現(xiàn)在典型家族性偏頭痛患者中TRESK 的基因發(fā)生了移位突變，TRESK 突變后，患者會更容易感到頭痛，對光線、聲音和觸碰也變得更敏感。

本研究結(jié)果顯示，骨癌痛大鼠脊髓背角TRESK 的表達較Sham 組明顯降低。這表明，TRESK 可能參與了骨癌痛的發(fā)生。其他的研究也發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)病理性疼痛中大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)TRESK 的表達降低［11－12］。我們推測在神經(jīng)損傷或受壓后，可能導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和脊髓背角神經(jīng)元細(xì)胞膜上的TRESK 表達降低，從而使鉀離子外流減少，細(xì)胞膜的靜息電位升高，神經(jīng)元的興奮性增加，放電頻率增加，導(dǎo)致異位放電，形成中樞敏化。

綜上所述，脊髓背角神經(jīng)元膜上的TRESK 在骨癌痛中可能起重要的作用。但骨癌痛改變TRESK 基因表達的具體機制還有待進一步探討。

［1］ Lafreniere R G，Cader M Z，Poulin J F，et al.A dominant－negative mutation in the TRESK potassium channel is linked to familial migraine with aura［J］.Nat Med，2010，16（10）：1157－1160.

［2］ 吳煥兵，張登文，夏輝，等.坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠相應(yīng)脊髓背角神經(jīng)元KATP通道表達的變化［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，40（4）：400－403.

［3］ Mao－Ying Q L，Zhao J，Dong Z Q，et al.A rat model of bone cancer pain induced by intra－tibia inoculation of Walker 256 mammary gland carcinoma cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，345（4）：1292－1298.

［4］ Latremoliere A，Woolf C J.Central sensitization：agenerator of pain hypersensitivity by central neural plasticity［J］.J Pain，2009，10（9）：895－926.

［5］ Everill B，Kocsis J D.Reduction in potassium currents in identified cutaneous afferent dorsal root ganglion neurons after axotomy［J］.J Neurophysiol，1999，82（2）：700－708.

［6］ 吳煥兵，趙邦娥，張登文，等.開胸術(shù)后慢性疼痛模型大鼠相應(yīng)脊髓背角神經(jīng)元KATP通道表達的變化［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2011，31（6）：699－701.

［7］ Czirjak G，Vuity D，Enyedi P.Phosphorylation－dependent binding of 14－3－3proteins controls TRESK regulation［J］.J Biol Chem，2008，283（23）：15672－15680.

［8］ Czirjak G，Enyedi P.Targeting of calcineurin to an NFAT－like docking site is required for the calcium－dependent activation of the background K＋channel，TRESK［J］.J Biol Chem，2006，281（21）：14677－14682.

［9］ Tulleuda A，Cokic B，Callejo G，et al.TRESK channel contribution to nociceptive sensory neurons excitability：modulation by nerve injury［J］.Mol Pain，2011，7：30.

［10］ Kang D，Kim D.TREK－2（K2P10.1）and TRESK（K2P18.1）are major background K＋channels in dorsal root ganglion neurons［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2006，291（1）：C138－C146.

［11］ Marsh B，Acosta C，Djouhri L，et al.Leak K＋channel mRNAs in dorsal root ganglia：relation to inflammation and spontaneous pain behaviour［J］.Mol Cell Neurosci，2012，49（3）：375－386.

［12］ 周俊，姚尚龍，楊承祥，等.神經(jīng)病理性痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRESK mRNA 表達的變化［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2011，31（2）：183－185.