MNNG誘導GES-1細胞惡性轉化細胞模型的建立

，，

(1 青島大學醫(yī)學院藥學系,山東 青島 266021； 2 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科； 3 中國海洋大學分子藥理室)

胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一, 其發(fā)生率和死亡率在各類腫瘤中仍居首位。胃癌在癌變前多數(shù)經(jīng)歷了較長的演變，目前較公認的胃癌發(fā)病模式為正常胃黏膜→腸上皮化生→異型增生→胃癌[1]。在這里發(fā)生了上皮細胞間質化(EMT)過程[2-5]。目前研究證實，胃癌與飲食因素中的亞硝基化合物, 尤其是亞硝胺類化合物有關[2]。本研究以N-甲基-N′-硝基N-亞硝基胍(MNNG)作用于永生化的人類胃黏膜上皮細胞GES-1[3]，系統(tǒng)地觀察細胞形態(tài)的變化，同時檢測細胞中神經(jīng)鈣黏附素(N-cadherin)與磷酸化信號傳導和轉錄激活因子3(P-STAT3)表達的改變,為今后深入研究EMT靶向藥物提供細胞模型?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 細胞株

永生化的人胃黏膜上皮細胞系GES-1購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 試劑

MNNG系美國Sigama公司產(chǎn)品，1640培養(yǎng)液、胎牛血清系美國GIBCO公司產(chǎn)品，抗體N-cadherin、P-STAT3、HRP-羊抗鼠二抗、HRP-羊抗兔二抗均系美國Cell Signalin公司產(chǎn)品，β-actin抗體系美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，ECL發(fā)光試劑系美國Thermo公司產(chǎn)品，一抗、二抗去除液系碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器與設備

超凈工作臺、臺式高速冷凍離心機、CO2培養(yǎng)箱系德國Heraeus公司產(chǎn)品，蛋白電泳系統(tǒng)系美國BIORAD公司產(chǎn)品，凝膠掃描成像系統(tǒng)系北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品，半干轉膜儀系大連竟邁生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 實驗方法

1.4.1GES-1細胞培養(yǎng) GES-1細胞在1640培養(yǎng)液(含體積分數(shù)0.10胎牛血清)中，于37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.4.2MNNG誘導GES-1細胞轉化 取對數(shù)生長期的GES-1細胞2.0×105個，種于60 mm培養(yǎng)皿中，每皿加入5 mL培養(yǎng)液，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng)過夜，加入2.0×10-5mol/L MNNG，避光培養(yǎng)24 h后，換新鮮1640培養(yǎng)液(含體積分數(shù)0.10胎牛血清)培養(yǎng)，1周左右可見大量細胞死亡脫落，殘存的細胞2周后長至70%～80%的飽和度時開始按GES-1細胞培養(yǎng)法消化傳代，傳至第4代時，凍存留用。

1.4.3GES-1、MC細胞中胃癌相關蛋白N-cadherin、P-STAT3表達的測定 分別取對數(shù)生長期的GES-1、MC細胞2.0×104個，種于6孔板中，每孔加3 mL培養(yǎng)液，于37 ℃，體積分數(shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng)過夜；收集細胞，制備蛋白電泳樣品，用預冷的PBS洗3次，各孔加入90 μL細胞裂解液，冰浴裂解30～40 min；刮取細胞裂解液，沸水煮5 min使蛋白變性，-20 ℃保存。采用Western Blot方法檢測N-cadherin與P-STAT3蛋白表達。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)學改變

GES-1細胞形態(tài)隨著繼續(xù)傳代從初始建株時的上皮樣細胞逐漸變?yōu)樗笮?，細胞之間排列稀疏，呈散在性生長。經(jīng)過MNNG處理后的細胞從初始的梭形，隨傳代的繼續(xù)形態(tài)逐漸變?yōu)椴灰?guī)則，細胞間接觸緊密，呈“島樣”克隆生長，克隆間界限清楚，以梭形細胞環(huán)繞。多數(shù)細胞具有單核，也出現(xiàn)多核巨大細胞，胞漿內可見空泡，命名為MC細胞。見圖1、2。

2.2 GES-1、MC細胞中胃癌相關蛋白N-cadherin表達的檢測

實驗結果顯示，MNNG誘導過后胃癌相關蛋白N-cadherin的表達量增多。見圖3。

2.3 GES-1、MC細胞中胃癌相關炎癥蛋白P-STAT3表達的檢測

實驗結果顯示，MNNG誘導過后P-STAT3 的表達量增多。見圖4。

3 討 論

EMT是指上皮細胞在正常的生理和特定的病理情況下向間充質細胞轉化的現(xiàn)象，是以上皮細胞喪失極性和黏附性并獲得間質特性為主要特征的一個復雜過程。在此過程中，一個重要的分子事件就是鈣黏蛋白表達的異常[6]，N-cadherin屬于鈣黏蛋白家族,為目前已知的與腫瘤轉移有關的黏附分子之一，N-cadherin與細胞間的黏附、分化、侵襲和信號傳導有關。N-cadherin在上皮細胞中,可促使細胞形態(tài)向成纖維細胞發(fā)展,是細胞侵襲、浸潤的促進者[7]。N-cadherin只表達于成熟的神經(jīng)、肌肉和造血組織等神經(jīng)外胚層和中胚層來源的組織，正常上皮組織往往不表達，這種N-cadherin在上皮組織中的異位表達可影響上皮細胞的形態(tài)和行為，誘導其發(fā)生向間質的轉化，即發(fā)生EMT。本實驗結果顯示，MNNG可以誘導GES-1細胞發(fā)生成纖維細胞樣形態(tài)改變，并導致N-cadherin分子高表達，表明MNNG誘導的GES-1細胞發(fā)生了EMT轉化。

圖1GES-1細胞形態(tài)

圖2MC細胞形態(tài)

圖3 胃癌相關蛋白N-cadherin的表達

圖4 胃癌相關炎癥蛋白P-STAT3的表達

研究顯示，STAT3及其磷酸化形式P-STAT3在人類多種惡性腫瘤，如胃癌、頭頸部鱗狀細胞癌、乳癌、結直腸癌等組織中均存在異常高表達或活性增強[8]。有研究認為，P-STAT3表達與胃癌侵襲、轉移及預后相關[9]。P-STAT3蛋白可以作為胃癌診斷和預后判斷的分子標志物，有望為深入研究胃癌的診斷與治療提供新的思路。本實驗結果顯示，MNNG誘導的GES-1細胞高表達P-STAT3，進一步說明MNNG作用后GES-1細胞具有了胃癌細胞的性質。

GES-1細胞是由人胎兒胃黏膜上皮細胞轉染SV-40病毒后獲得的永生化的細胞系，可以在體外穩(wěn)定傳代,但保留了正常的細胞骨架結構,在裸鼠體內不致瘤,在軟瓊脂中也不形成集落,被認為在體外研究胃黏膜的癌變有較大價值[4]。

本研究使用與胃癌相關的亞硝胺類化合物MNNG對永生化的人胃黏膜上皮細胞系GES-1進行惡性轉化實驗,成功誘導得到了胃癌癌前病變的細胞，為深入研究治療EMT的靶向藥物提供了一種細胞模型。

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