茶多酚并紫杉醇對食管癌Eca-109細(xì)胞增殖與凋亡影響

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,山東 青島266003 1 腫瘤科； 2 中心實驗室)

食管癌是世界常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有30萬人死于食管癌，位居腫瘤死因第6位。目前，對食管癌的治療，早期以根治性手術(shù)為主，對食管癌尤其晚期病人化療仍占有非常重要的地位，但總有效率并不樂觀。因此，尋找對食管癌更有效的藥物和治療方法具有重要意義。目前認(rèn)為紫杉醇(Paclitaxe)是治療食管癌最有效的藥物之一，單藥緩解率(RR)為32%[1]，是臨床上一線治療食管癌的藥物，但因毒副作用嚴(yán)重，其應(yīng)用及療效受到了限制。大量實驗證實，綠茶提取物茶多酚(TP)可通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[2-3],但TP對食管癌體外作用的報道少見。本研究以不同濃度的TP、Paclitaxel對食管癌Eca-109細(xì)胞分別進(jìn)行單獨及聯(lián)合用藥，檢測TP、Paclitaxel對腫瘤細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)基因Caspase-3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及來源

Paclitaxel(相對分子質(zhì)量853.92)，哈藥集團(tuán)生物工程有限公司生產(chǎn)； TP(含量98%)，西安奧澤生物科技有限公司生產(chǎn)，用高純水配成濃度5 g/L溶液，直徑0.22 μm的濾器過濾，置于-20 ℃冰箱，避光保存?zhèn)溆?；RPMI-1640培養(yǎng)液與胎牛血清，均為Hycloneg公司產(chǎn)品；溴化噻唑藍(lán)四唑(MTT)，Sigma公司產(chǎn)品；AnnxineV/PI凋亡檢測試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所；Caspase-3引物[4](上游引物：5′-TGGAACAAATGGACCTGTTGACC-3′，下游引物：5′-AGGACTCAAATTCTGTTGCCACC-3′)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，預(yù)擴增片段為365 bp；逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司。內(nèi)參照基因為GAPDH，上游引物: 5′-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3′, 下游引物：5′-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3′，預(yù)擴增片段為135 bp。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

食管癌Eca-109細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(內(nèi)含100 kU/L青霉素和100 kU/L鏈霉素)培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 細(xì)胞增殖抑制的檢測

采用MTT法。收集處于對數(shù)生長期的Eca-109細(xì)胞，以1×107/L的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng),等待細(xì)胞完全貼壁。將處于對數(shù)期的細(xì)胞隨機分為TP組、Paclitaxel組、兩藥聯(lián)合組，分別加入100 μL含不同濃度TP(125、250、500、1 000 mg/L)、Paclitaxel(0.2、1.0、5.0、25.0 mg/L)及TP+Paclitaxe(500 mg/L TP+1 mg/L Paclitaxel)的培養(yǎng)液，并設(shè)立陰性對照組、空白對照組，每組5個副孔。置于培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔加150 μL MTT，避光培養(yǎng)4 h，將孔內(nèi)液體吸出，再向每孔內(nèi)加20 μL的二甲基亞砜，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測定490 nm處的吸光度(A)值，計算細(xì)胞增殖抑制率(IR)。IR=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板，每孔2 mL、細(xì)胞數(shù)40×104，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，等待細(xì)胞貼壁。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機分為TP組(500 mg/L)、Paclitaxel組(1 mg/L)、 兩藥聯(lián)合組(TP 500 mg/L+1 mg/L Paclitaxel)組，對照組不加藥物，24 h后，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.5 細(xì)胞凋亡周期與細(xì)胞凋亡率檢測

1.5.1細(xì)胞凋亡周期的檢測 采用PI單染法。細(xì)胞處理及實驗分組同1.4，每組設(shè)3個副孔。收集細(xì)胞至離心管，1 000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞，去上清。加入1 mL預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)0.70的乙醇，混勻，4 ℃固定24 h。離心，去上清，PBS洗滌。每管內(nèi)加入PI 25 μL、RNaseA 10 μL，緩慢并充分重懸，400目篩網(wǎng)過濾，37 ℃避光溫浴30 min,流式細(xì)胞儀(美國B.D公司)檢測細(xì)胞周期的分布。

1.5.2細(xì)胞凋亡率的檢測 采用AnnxineV/PI雙染法。細(xì)胞處理及實驗分組同1.4，每組設(shè)3個副孔。收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞，去上清，冷PBS洗滌。再離心，去上清，重懸細(xì)胞于100 μL 1×buffer中。加入AnnexinV 5 μL +PI1 μL，室溫下培育15 min。加入400 μL 1×buffer，充分重懸細(xì)胞，400目篩網(wǎng)過濾，用流式細(xì)胞儀(美國B.D公司)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 Caspase-3 mRNA檢測

采用半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法。細(xì)胞處理及實驗分組同1.4，藥物作用24 h后，收集細(xì)胞，加入TRIzol、氯仿、異丙醇、冰預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇提取細(xì)胞總RNA。取總RNA5 μL，在PCR儀上行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件：65 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min變性，退火反應(yīng)，45 ℃ 20 min，95 ℃ 5 min。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，引物0.4 μL，總反應(yīng)液10 μL，在PCR儀上行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：95 ℃5 min變性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,以內(nèi)參基因GAPDH作對照，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)半定量分析Caspase-3 mRNA的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 TP和Paclitaxel對Eca-109細(xì)胞IR的影響

隨著TP、Paclitaxel濃度升高和作用時間延長，細(xì)胞IR增加，差異有顯著性(F=134.46～423.75，P<0.05)。兩藥聯(lián)合組作用12、24、48 h，對細(xì)胞的IR分別明顯高于TP組、Paclitaxel組(q=8.63～26.96，P<0.05)。采用相互作用指數(shù)[5](CDI)評價兩藥的相互作用(CDI=AB/(A×B)，其中A、B是兩藥單獨作用吸光度值與對照組吸光度值的比值，AB為兩藥聯(lián)合組吸光度值與對照組吸光度值比值。CDI>1時，兩藥相互作用為拮抗作用；CDI=1，兩藥作用性質(zhì)為相加；CDI<1時，兩藥相互作用為協(xié)同)。結(jié)果顯示，作用12、24、48 h，CDI值分別為0.91、0.89、0.85，兩藥有協(xié)同作用(圖3)。

2.2 TP和Paclitaxel對Eca-109細(xì)胞形態(tài)的影響

光鏡下，TP組、Paclitaxel組、兩藥聯(lián)合組細(xì)胞稀疏，形態(tài)變圓，細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)致密，細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)內(nèi)有凋亡小體產(chǎn)生，兩藥聯(lián)合組表現(xiàn)更為明顯(圖4)。對照組細(xì)胞密集，貼壁生長，分裂旺盛，形態(tài)規(guī)則，呈鋪路石樣改變，細(xì)胞核位于細(xì)胞中部(圖5)。

2.3 TP和Paclitaxel對Eca-109細(xì)胞周期及凋亡率的影響

2.3.1細(xì)胞周期 TP、Paclitaxel及兩藥聯(lián)合誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞24 h后，細(xì)胞周期均發(fā)生明顯改變，G1期細(xì)胞數(shù)與對照組比較明顯增高(F=54.52,q=5.39～17.53,P<0.05)，而S期與G2期細(xì)胞比例減少。見表1。

2.3.2細(xì)胞凋亡率 TP組、Paclitaxel組、兩藥聯(lián)合組誘導(dǎo)24 h的Eca-109細(xì)胞凋亡率分別為(17.54±0.95)%、(10.27±0.93)%、(25.24±0.91)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=446.82，q=16.27、31.64，P<0.05)。

2.4 TP和Paclitaxel 對食管癌Eca-109細(xì)胞Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

與TP組、Paclitaxel組比較，兩藥聯(lián)合組誘導(dǎo)24 h后，Eca-109細(xì)胞Caspase-3 mRNA的表達(dá)量分別增高17.22%、11.63%，差異有顯著意義(F=108.33，q=30.37、20.52，P<0.05)。見圖6。

3 討 論

食管癌是全世界高發(fā)惡性腫瘤之一，臨床確診時大多數(shù)病例已屬中晚期，化療在食管癌的治療中占重要地位。Paclitaxel為食管癌的臨床一線用藥，是治療食管癌最有效的藥物之一，但其毒副作用比較嚴(yán)重。在體外，TP可通過選擇性阻斷信號傳導(dǎo)通路、抑制尿酸氧化酶活性等多種途徑抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。但TP對食管癌的體外作用以及TP聯(lián)合Paclitaxel對食管癌的作用國內(nèi)罕見報道。

細(xì)胞增殖失控是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征。本文研究顯示，TP、Paclitaxel均能顯著抑制食管癌Eca-109細(xì)胞的增殖，并與時間、濃度呈正相關(guān)，這與有關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果相似[7-8]。而當(dāng)兩藥聯(lián)用時，對食管癌Eca-109細(xì)胞的IR明顯提高。光鏡及流式細(xì)胞儀均能觀察到細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其中兩藥聯(lián)合組更加明顯。提示TP能抑制Eca-109細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與Paclitaxel聯(lián)用能增強其抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

凋亡是細(xì)胞的程序化死亡過程，如細(xì)胞凋亡受阻可導(dǎo)致腫瘤無限增殖。本文結(jié)果顯示，Eca-109細(xì)胞經(jīng)TP、Paclitaxel及兩藥聯(lián)合作用后，均出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯，G1期細(xì)胞比例增高，也出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，表明細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能也是TP、Paclitaxel抗腫瘤作用的重要機制之一。

表1 兩藥對Eca-109細(xì)胞周期的影響(n=3,χ/%)

圖1 TP對Eca-109細(xì)胞IR的影響

圖2 Paclitaxel對Eca-109細(xì)胞IR的影響

圖3 TP、Paclitaxel聯(lián)合對Eca-109細(xì)胞IR的影響

圖4 兩藥聯(lián)合組Eca-109細(xì)胞形態(tài) (×100)

圖5 對照組細(xì)胞形態(tài) (×100)

M為Marker;①、⑤對照組；②、⑥TP組；③、⑦Paclitaxel組；④、⑧兩藥聯(lián)合組。

細(xì)胞凋亡是非常復(fù)雜的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程。目前認(rèn)為藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡受一個或多個基因的調(diào)控[9]。眾所周知，Caspase-3為與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白酶家族[10]。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的典型途徑包括：對Caspase-3的依賴性(細(xì)胞外途徑)和對線粒體靶向性(細(xì)胞內(nèi)途徑)，而Caspase-3是兩種細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者，是級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[11-12]。Caspase-3由12 000和17 000大小兩個亞基構(gòu)成，是編碼35 000大小半胱氨酸蛋白酶的基因。TP在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程中，具有對Caspase-3的依賴性和線粒體靶向性[13]。本文結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞凋亡率增加，Caspase-3 mRNA表達(dá)增加，提示Caspase-3 mRNA的表達(dá)與細(xì)胞凋亡過程有關(guān)，但其信號傳導(dǎo)具體途徑仍不清楚，可能與Caspase-3的活化相關(guān)。由于活化的Caspase-3能特異性地切斷DNA，使參與DNA損傷修復(fù)過程中的DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)和聚ADP核糖聚合酶(PARP)失活，導(dǎo)致核酸激活和染色質(zhì)聚集，促使細(xì)胞凋亡[14]。ODONKOR等[15]的研究結(jié)果表明，Caspase-3依賴性途徑是Paclitaxel細(xì)胞毒性作用的重要途徑，Caspase活化和效能對Paclitaxel治療腫瘤的敏感性具有良好的指示作用。本研究RT-PCR結(jié)果顯示，TP組、Paclitaxel組和兩藥聯(lián)合組Caspase-3表達(dá)均增高，兩藥聯(lián)合組作用更明顯，這與流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果一致，提示TP、Paclitaxel誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與上調(diào)Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，TP和Paclitaxel不僅能抑制食管癌Eca-109細(xì)胞的分裂，阻滯細(xì)胞周期于G1期，使其增殖指數(shù)下降，從而抑制細(xì)胞的增殖，而且在一定的范圍內(nèi)呈時間、濃度依賴性；同時，二者也可通過上調(diào)Caspase-3表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示Caspase-3 mRNA表達(dá)與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。但TP、Paclitaxel通過Caspase-3信號傳導(dǎo)通路途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體機制并不清楚，尚需更深入的研究。

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